氧氣脅迫對長雙歧桿菌葡萄糖代謝關鍵酶基因表達的影響

趙建云，馬會勤，肖 滿，左芳雷，陳尚武,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193）

氧氣脅迫對長雙歧桿菌葡萄糖代謝關鍵酶基因表達的影響

趙建云1，馬會勤2，肖 滿1，左芳雷1，陳尚武1,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193）

雙歧桿菌對氧氣敏感，耐氧性成為其重要的性狀及研究內容之一。實驗采用半定量RT-PCR法對在4%氧氣條件下培養(yǎng)的長雙歧桿菌BBMN68的葡萄糖代謝中關鍵酶基因mRNA表達水平進行了比較和分析。結果表明，隨著氧氣濃度增加，長雙歧桿菌BBMN68的生長逐漸受到抑制，在4%濃度脅迫條件下，葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、磷酸酮醇酶、轉酮醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在氧脅迫30min時的mRNA表達明顯下降，60min及120min后，xfp和gap酶的mRNA表達量恢復到厭氧條件下的水平。研究了長雙歧桿菌在氧氣脅迫下菌體生長以及葡萄糖代謝中關鍵酶基因mRNA的變化情況，這些可能是細胞受到氧氣脅迫的應激反應之一，推測葡萄糖代謝酶與長雙歧桿菌耐氧性有一定關聯(lián)。

長雙歧桿菌BBMN68，耐氧性，葡萄糖代謝酶，半定量RT-PCR

益生菌需要保持很高的活菌數才能發(fā)揮其對于宿主的各種生理功能[1]，但由于外界環(huán)境因素會影響其活菌數，特別是在有氧條件下，雙歧桿菌會形成H2O2、O2-·、HO·等活性氧[2]，活性氧在細胞內積累，會對細胞形成毒害作用，限制了其益生功能的發(fā)揮。不同菌株有不同程度的耐氧性[3]，有些菌株可經人工耐氧馴化后提高自身耐氧能力[4]。雙歧桿菌耐氧性研究有利于保持雙歧桿菌制劑中較高的活菌量和其擴大生產等實際應用。人們已經對于雙歧桿菌的耐氧機理進行了一些探索與研究[5-6]，但主要集中在細胞水、分子水平研究，有待進一步擴展。已有的研究表明，氧氣會影響雙歧桿菌的糖代謝[7]。雙歧桿菌對葡萄糖的代謝是經由特殊的雙歧支路代謝途徑[5]，其中果糖-6-磷酸解酮酶是雙歧桿菌特殊的支路代謝途徑中關鍵性酶（見圖1）。雙歧桿菌葡萄糖代謝酶的基因在環(huán)境脅迫下會發(fā)生表達量的變化[8-9]。研究氧氣脅迫下葡萄糖代謝途徑中代謝酶mRNA水平，能夠對雙歧桿菌在有氧環(huán)境下的代謝與耐氧性的分子機制作進一步的研究和探索，對于拓寬雙歧桿菌的應用范圍具有深遠意義。本研究對4%氧氣濃度條件下長雙歧桿菌BBMN68中葡萄糖代謝關鍵酶基因的表達進行了研究，旨在了解長雙歧桿菌葡萄糖代謝中關鍵酶與耐氧性間的關系，探索長雙歧桿菌耐低氧可能的分子機制,為雙歧桿菌益生菌株的篩選、改造和應用提供基本研究材料，為進一步從代謝水平上闡明長雙歧桿菌對低氧脅迫的反應機制奠定基礎。

圖1 雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑（主要途徑）

1 材料與方法

1.1 材料與設備

供試材料 長雙歧桿菌BBMN68（Bifidobacterium longumBBMN68），由中國農業(yè)大學功能乳品重點實驗室篩選，中科院微生物所菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC2265；實驗采用改造的MRS培養(yǎng)基（不加半胱氨酸鹽酸鹽），采用亨蓋特厭氧滾管及300mL膠塞密封瓶培養(yǎng)雙歧桿菌，培養(yǎng)基上方充入氮氣來保證厭氧條件；TRIZOL試劑 美國Invitrogen（上海）英俊生物技術有限公司；氯仿，異丙醇，無水乙醇，DEPC，反轉錄酶M-MLV（promega），DL2000DNAmarker TaKaRa公司，大連；引物合成 美國Invitrogen（上海）英駿生物技術有限公司完成；rTaq DNA聚合酶，DNase I RNasefree（TaKaRa） 大連寶生物工程有限公司；Random引物 TIANGEN。

低溫離心機，超凈工作臺，核酸分析儀，PCR儀，培清JS-680c全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；照相電泳儀、微量分光光度計 GeneDrop?ND-1000，Gene Company Limited。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙歧桿菌培養(yǎng) 將冷凍保藏菌種，以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h，連續(xù)活化兩代作為種子培養(yǎng)液。B.longum BBMN68菌株在10mL培養(yǎng)基的亨蓋特厭氧管中厭氧培養(yǎng)，活化后的菌種按1%接菌量接入100mL培養(yǎng)基中（培養(yǎng)瓶總體積為300mL，充入氮氣后用密封膠塞密封，滅菌），37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.6時，設置對照組和實驗組，實驗組以4%（體積分數）空氣注入，并與對照組同時放入搖床中100r/min分別培養(yǎng)30、60、120mim，離心收集菌體，液氮速凍，立即提取總RNA。

本文采用的是按比例向基質中注入空氣，增加基質上方氧分壓，進而增加基質中溶氧量的方法來進行氧適應[10]。

1.2.2 引物設計與合成 PCR引物根據GenBank提供的相關序列（Genbank accession number NC_004567）采用Primer 5.0設計，并由美國Invitrogen（上海）英俊生物技術有限公司合成。實驗所選各個基因引物序列及擴增片段大小見表1。

1.2.3 長雙歧桿菌BBMN68生長曲線的測定 將活化的菌種按1%接菌量接入100mL培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2h取出3個培養(yǎng)瓶用分光光度計測量其600nm處的吸光度，以不含菌液的空白培養(yǎng)基管為空白，平行實驗重復3次，取平均值，以此作為對照組，同時設置實驗組，當其培養(yǎng)至對數期OD600nm為0.6左右時，用50mL注射器充入一定體積空氣，使培養(yǎng)瓶中氧氣體積占4%（體積分數），于搖床中以100r/min的轉速37℃恒溫培養(yǎng)，同樣每隔2h取樣檢測，平行實驗重復3次。最后以吸光度為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線（見圖2）。同時取樣進行培養(yǎng)基pH的測定，并繪制pH變化曲線（見圖3）。

表1 實驗所用引物名稱及序列

1.2.4 總RNA提取及含量測定 總RNA提取采用Trizol法（Invetrogen，USA），具體操作按照Trizol試劑盒說明書進行。

分別在厭氧生長組和氧氣處理組的雙歧桿菌培養(yǎng)液中取樣。首先取10mL培養(yǎng)液放入離心管中進行4℃離心，10000×g離心2min，然后棄去上清液，用緩沖液洗滌菌體，4℃離心，收集菌體，迅速加液氮冷凍。經過裂解、分離、沉淀、洗滌及溶解步驟得到總RNA。

以不含RNase的DNase進行RNA純化處理，消除RNA中可能帶有的DNA。消化后的RNA采用微量分光光度計（ND-1000，美國）測定純度及定量（OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm），1%瓊脂糖凝膠垂直電泳（120V，15min左右）鑒定RNA提取質量，調整各樣總RNA濃度至100ng/μL。備用總RNA樣品冷存于-80℃中用于后續(xù)反轉錄反應。

1.2.5 反轉錄 進行反轉錄的反應體系為20μL/管，反應液的配制在冰上進行，用反轉錄酶M-MLV反轉合成cDNA第一鏈。

反轉錄體系為：2μL RNA樣品和2μL隨機引物加在試管底部，70℃水浴10min，立即冰浴5min，離心，在冰上加入8μL RNase free ddH2O，4μL RT-Buffer，1μL RNA酶抑制劑，2μL超純dNTP，1μL反轉錄酶MMLV，離心，37℃反應1h，95℃加熱滅酶5min，冰浴5min，RT產物測定含量后，放入-20℃環(huán)境下保存。

1.2.6 PCR反應體系及產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測 以反轉錄后的cDNA為模板，用自行設計的各個基因的特異引物進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL，其成分如下：2.5 μL 10×PCR buffer；2μL dNTP（2.5μmol·L-1）；上、下游特異性引物10μmol·L-1各1μL；0.25μL rTaq DNA聚合酶，1μL模板（cDNA-1），補ddH2O至25μL。10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA聚合酶均為TaKaRa公司產品。PCR反應擴增程序為：95℃預變性1min，94℃變性30s，不同的基因在各自適當的退火溫度下退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)數（不同基因的最適循環(huán)數通過實驗進行選擇），72℃充分延伸10min，4℃，停止。

取每個樣品的目的基因RT-PCR產物5μL，同1μL上樣緩沖液混合均勻，分別點樣于2%瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5μL DL2000 Marker，120V電壓下電泳20min左右。電泳結束后，使用培清JS-680c全自動凝膠成像分析儀照相，并用儀器自帶軟件進行數據分析，測定不同培養(yǎng)條件下菌體中各個基因水平。用凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進行光密度比較分析，確定目的基因在組織樣品中表達量的相對值。

2 結果與分析

2.1 長雙歧桿菌BBMN68生長曲線

為了解長雙歧桿菌BBMN68在不同氧氣濃度條件下的生長情況，并以此來確定實驗采用的氧氣脅迫濃度，實驗測定了長雙歧桿菌BBMN68分別在0、2%、4%和6%氧氣脅迫條件下不同時間的吸光值和pH，并繪制了生長曲線及pH變化曲線（見圖3和圖4）。從圖中可以看出，長雙歧桿菌BBMN68于2h時后進入對數生長期，在14h時進入平臺期；2%～6%的氧氣濃度對菌株生長有影響，2%氧氣濃度影響生長比較小，生長曲線和無氧條件相似，但最高OD值小于厭氧培養(yǎng)的菌株，4%氧氣條件下，菌株首先進入一個遲滯期，4h后進入對數生長期，在14h左右進入平臺期；但最高OD值低于厭氧培養(yǎng)和2%氧氣濃度下生長的菌株，6%的氧氣條件下雙歧桿菌處于停滯的狀態(tài)，生長狀態(tài)基本保持不變。為了讓菌株既受到氧氣脅迫的影響，也不生長停滯死亡，因此選擇4%氧氣濃度作為實驗中氧氣脅迫長雙歧桿菌BBMN68的氧氣濃度。

結果顯示，隨著培養(yǎng)基上方氧氣濃度的增加，長雙歧桿菌BBMN68的生長受到抑制增強，2%和4%氧氣條件下已表現這種趨勢，到6%氧氣條件時，BBMN68的生長受到強烈的抑制。雙歧桿菌在代謝過程中會產生一些有機酸代謝產物[11]，這些物質會使培養(yǎng)基的pH隨著培養(yǎng)時間的增加而降低，其生長狀態(tài)越好，產生的有機酸代謝產物就越多。從圖3可以看出，隨著氧氣濃度的增加，pH降低的程度相應減少，這說明在適應氧氣脅迫的同時，雙歧桿菌的生長狀態(tài)發(fā)生了調整。

圖2 長雙歧桿菌BBMN68在不同氧氣濃度條件下的生長曲線圖

圖3 長雙歧桿菌BBMN68在不同氧氣濃度條件下pH的變化曲線圖

2.2 長雙歧桿菌葡萄糖代謝關鍵酶基因表達的半定量PCR檢測

2.2.1 半定量RT-PCR循環(huán)數的確定 在PCR擴增對數期，模板量與擴增產量成正比，而在PCR擴增后期，其產量將不隨模板量的增加而增加。適宜循環(huán)次數的多少與cDNA鏈中該基因片段模板數量呈線性相關，與條帶的亮度呈指數相關。為了準確反映不同培養(yǎng)條件下葡萄糖代謝酶基因表達，在進行半定量PCR時，要求PCR擴增不進入平臺期。實驗選取同一樣本cDNA，分別用所選葡萄糖代謝酶和16S rRNA的PCR擴增引物進行了24、26、28、30、32、34和36個循環(huán)擴增(見圖4)。實驗結果顯示，當葡萄糖代謝酶基因達到34循環(huán)時條帶的吸光值基本達到恒定。因此32循環(huán)被共同RT-PCR擴增所采用。

圖4 長雙歧桿菌BBMN68不同循環(huán)次數擴增所選代謝酶、16SrRNA產物電泳

2.2.2 以16S為內參基因對氧氣脅迫前后基因的表達進行相對定量驗證。

2.2.2.1 內參基因16S rRNA的表達水平 RT-PCR方法以內參基因（internal reference gene）的表達量對目標基因的表達量進行歸一化，對目標基因的表達水平進行相對量化。

圖5 內參基因16SrRNA在氧氣處理前后的電泳圖和表達量比較

對自行設計的16S rRNA特異性引物進行PCR擴增，2%瓊脂糖電泳檢測到了預期大小的基因片段：184bp的16S rRNA基因片段（見圖5）。電泳圖片條帶清晰，無非特異性擴增帶。為了進一步對16S的表達量進行驗證，取上述電泳條帶的灰度值進行計算、作圖，見圖5。可以看出二者沒有顯著性差異，16S rRNA的表達量在不同的菌體培養(yǎng)條件下一致，可以作為內參基因。

2.2.2.2 對照組和氧氣脅迫下雙歧桿菌部分代謝基因的表達 為了確保PCR擴增產物的特異性，實驗將PCR產物回收后進行了克隆測序，其中目的基因各個代謝酶基因大小與預期的一致，參比基因16S rRNA為184bp（見圖5）。測序結果表明PCR擴增產物確為代謝酶基因片段。根據長雙歧桿菌BBMN68的生長曲線，實驗確定在菌體進入對數生長期，即在培養(yǎng)8h時回收菌體并提取總RNA。參照RT-PCR反應循環(huán)次數確定實驗結果，以16S rRNA作為看家基因，檢測長雙歧桿菌中關于葡萄糖代謝中的6個關鍵酶基因（tal、pgm、gpi、tkt、xfp、gap）。在4%氧氣濃度處理30、60、120min后的表達情況。圖6是在氧氣脅迫下以上各個基因的相對表達情況。按照半定量RT-PCR的要求，樣品采用三次重復。根據16S rRNA內參基因調整的體系擴增選定基因。對4%氧氣脅迫下30、60、120min的所選基因表達情況進行檢測，用所選基因與16S rRNA基因PCR擴增產物的比值來表示各個所選基因在氧脅迫下的變化趨勢（見圖6）。由圖6可見，長雙歧桿菌BBMN68在對數中期受氧氣脅迫后，各個代謝酶隨時間延長，其RNA的表達都呈下降趨勢，在氧氣脅迫30min的時候表現最明顯，隨著氧氣脅迫時間的延長，雙歧桿菌代謝酶mRNA的水平又有所回升，如xfp、tkt和gap。這些基因編碼的蛋白酶對菌株生長起關鍵作用。實驗結果反映了長雙歧桿菌BBMN68葡糖糖代謝關鍵酶同細胞受氧氣脅迫反應的相互關系，從長雙歧桿菌葡萄糖代謝的角度來看，長雙歧桿菌BBMN68短時適應低氧壓力的原因，可能是葡萄糖代謝中關鍵酶的變化。

圖6 代謝酶基因擴增電泳圖和氧氣脅迫前后基因的表達量變化

3 討論

有氧條件下，雙歧桿菌會形成H2O2、O2-·、HO·等活性氧[6]?；钚匝跄軌驍U散到細胞內，并氧化破壞細胞內的重要物質，如：細胞膜脂質、酶和DNA[12-14]。雙歧桿菌耐氧性是其重要的研究內容之一，多年來，許多研究者致力于雙歧桿菌的耐氧性能及其機制的研究，基本都是從細胞水平上闡明雙歧桿菌的耐氧機制。Kawasaki S[6]發(fā)現B.boumJCM 1211T和B.thermophilumJCM 1207T能夠在含20%氧氣的環(huán)境下生長。Li Qingqing[3]分離鑒定了一株耐氧的雙歧桿菌Bifidobacterium animalis subsp.lactisQq08，比已商業(yè)化的菌株Bifidobacterium lactisBb12更具有優(yōu)良性能。Shimamura等建立了幾種雙歧桿菌對于氧氣敏感度的生化機制，得出結論認為NADH氧化酶和NADH過氧化物酶在阻止氧氣毒害中起著重要的作用[15]。Talwalkar等[10]研究表明，不同的氧氣濃度促使雙歧桿菌的NADH氧化酶活力提高1.5～3倍，NADH過氧化物酶活力提高1.5～2倍，可能是由于氧氣誘導產生更多的NADH氧化酶和NADH過氧化物酶，以便抵制氧的毒性作用。在氧化應激條件下，細胞會激活許多蛋白質的合成，即發(fā)生氧化應激反應。合成的蛋白質能夠應付氧化應激的破壞作用，進而提高細胞抵制氧化應激能力。Schell等[16]對B.longumNCC2705的基因組序列進行了分析，發(fā)現了三種可能與雙歧桿菌耐氧性有關的酶基因：巰基過氧化物酶基因、烷基過氧化物酶基因（ahpC）和肽蛋氨酸亞砜還原酶基因，這些酶能夠抵制活性氧對蛋白質和脂質的氧化破壞。

雙歧桿菌對葡萄糖的代謝途徑不同于乳酸菌的同型或異型發(fā)酵，而是經由特殊的雙歧支路代謝途徑，在氧適應條件下，雙歧桿菌的部分性質會發(fā)生變化，糖代謝中的部分基因的表達量在酸性、膽鹽等應激反應中都會有變化，其中果糖-6-磷酸磷酸酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的表達在各種應激反應中都有降低的變化[8-9]。

本實驗對有氧條件下長雙歧桿菌BBN68中葡萄糖在雙歧支路代謝中的代謝酶基因表達的研究表明，隨著培養(yǎng)基上方氧氣濃度的增加，長雙歧桿菌BBN68中葡萄糖代謝酶（包括果糖-6-磷酸磷酸酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的mRNA）的表達水平呈明顯的下降趨勢，本實驗進行了更長時間的脅迫，發(fā)現隨著時間的延長，果糖-6-磷酸磷酸酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶等代謝酶的mRNA水平又能恢復，即經過一段時間的氧氣脅迫后菌株還是可以生長的，暗示著雙歧桿菌細胞體內有消除氧氣危害的機理，這種機制可能和代謝酶之間有關系。說明在長雙歧桿菌中，其葡萄糖代謝酶的活性是隨著培養(yǎng)環(huán)境中氧氣的增加而降低的，從而暗示了代謝酶的存在有利于長雙歧桿菌BBMN68在有氧條件下的生長，從葡萄糖代謝關鍵酶的mRNA水平說明了氧氣對于雙歧桿菌的生長及部分酶表達的變化的影響作用。該實驗結果與前人在雙歧桿菌與其他研究所做的環(huán)境脅迫下糖代謝酶表達變化結果相一致[8-9]，在環(huán)境的脅迫下，雙歧桿菌葡萄糖在雙歧支路途徑中的代謝酶的表達都有下降的趨勢?？梢酝茰y，在長雙歧桿菌中糖代謝部分酶與其耐氧性是有一定關聯(lián)的。細胞受到氧氣的毒害后，生長緩慢以適應不利環(huán)境，同時啟動雙歧桿菌氧應激反應，隨著時間的延長，氧毒害減輕，細胞恢復生長。至于啟動什么氧應激反應機制，有待于進一步研究。本文葡萄糖代謝關鍵酶的mRNA水平的變化可能是氧應激反應中的一種。

半定量RT-PCR是基于基因轉錄mRNA水平對基因表達的檢測，影響PCR的因素較多，本實驗用半定量PCR進行了4%氧氣不同時間的脅迫對長雙歧桿菌BBMN68葡萄糖代謝關鍵酶基因表達的影響研究，說明了代謝酶與氧氣脅迫之間可能存在的關系，隨著菌株培養(yǎng)環(huán)境中氧氣含量的變化，葡萄糖在雙歧支路代謝途徑中的部分代謝酶的表達也發(fā)生了變化，可以推測這些變化的酶和雙歧桿菌本身的抵抗氧氣的機制有著密切關系。實驗只是進行了一個氧氣濃度4%不同時間的脅迫，為了更進一步探討氧氣脅迫與代謝酶之間的關系，說明長雙歧桿菌的耐氧分子機制，在此實驗的基礎上，我們還準備進行不同氧氣濃度各個時期不同時間的脅迫，準備采用蛋白質雙向電泳（2D-PAGE）、熒光差異凝膠電泳（2DDIGE）等手段對差異蛋白基因表達進行研究，我們計劃在以后的實驗中采用基因敲除、RNA干擾等技術，為進一步確定葡萄糖代謝酶與長雙歧桿菌耐氧性能之間的關系，深入闡明長雙歧桿菌BBMN68在有氧條件下存活可能的分子機理，為乳酸菌益生菌株的篩選、遺傳改造和應用提供基本研究數據。

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Expression of key enzymes in glucose metabolism associated with oxygen condition in bifidobacterium longum BBMN68

ZHAO Jian-yun1,MA Hui-qin2,XIAO Man1,ZUO Fang-lei1,CHEN Shang-wu1,*

（1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China；2.College of Agriculture and Biotechnology,China Agricultural University,Beijing 100193,China）

Bifidobacteria is a kind of anaerobic bacteria，the ability of oxygen tolerance is one of the most important properties of Bifidobacteria.To investigate the genes expression of glucose of Bifidobacterium Longum BBMN68 which incubated in different oxygen condition，a semi-quantitative RT-PCR method was used to detect the key enzyme genes expression in 4%oxygen condition.The results indicated that the growth of Bifidobacterium Longum BBMN68 had been restrained by the oxygen stress，the mRNA level of the enzymes was depressed under 4%oxygen condition for 30 minutes，however，the mRNA level of xfp and gap had recovered under 4%oxygen condition for 60 minutes and more.Maybe it had some relationship between glucose metabolism enzymes and the growth ability of Bifidobacterium Longum BBMN68 in oxygen condition.

BifidobacteriumLongumBBMN68；oxygentolerance；glucosemetabolismenzymes；semi-quantitative RT-PCR

Q786

A

1002-0306（2011）10-0220-06

2010－10－20 * 通訊聯(lián)系人

趙建云（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

國家自然科學基金支持項目（31071507）。