響應(yīng)面法優(yōu)化榴蓮皮中總黃酮的提取工藝

李 娜，董 明，張國慶，俞雅瓊

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036)

響應(yīng)面法優(yōu)化榴蓮皮中總黃酮的提取工藝

李 娜，董 明*，張國慶，俞雅瓊

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036)

以榴蓮皮為原料，利用超聲波乙醇浸提法，采用響應(yīng)面設(shè)計，對榴蓮皮中的總黃酮提取工藝進行研究。通過單因素和響應(yīng)面實驗，建立了榴蓮皮中總黃酮含量與五個因素變化的二次回歸方程。同時依據(jù)回歸模型進行了計算機模擬實驗及繪制曲面圖，了解榴蓮皮中總黃酮含量隨兩個主要因素水平的變化方向及優(yōu)化點，并對所提取的黃酮類物質(zhì)進行驗證。結(jié)果表明:乙醇濃度為50%，料液比為30∶1，超聲溫度為47℃，超聲時間為40min，超聲功率為200W的條件下，榴蓮皮醇提液提取總黃酮含量為30.0046mg/g，即提取率為3.00046%，回收率為100.09%。其在此條件下提取液的烘干粉中黃酮含量約為26%。

榴蓮皮，黃酮，響應(yīng)面法，超聲波

榴蓮(Durio zibethinusMurr)。又名韶子，系木棉科長綠喬木。榴蓮是果實、風(fēng)味奇異的熱帶大型鮮果，素有“南洋水果之王”的美稱。原產(chǎn)于馬來西亞，主要在東南亞種植，我國主要在海南省東南部和南部種植［1］。榴蓮果中營養(yǎng)極其豐富，除了含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素以外，還含有人體必需的礦質(zhì)元素和氨基酸，其中K和Ca的含量特別高，除色氨酸外，含有7種人體必需氨基酸［2－3］。國內(nèi)外研究表明，榴蓮還含有多酚、黃酮、花青素、黃烷醇，尤其是成熟的榴蓮果中含有咖啡酸和槲皮素兩種抗氧化成分［4］。在榴蓮果中，多酚和黃酮有抵抗大鼠動脈硬化的作用［5］，同時榴蓮與山竹、蛇果的健康價值和營養(yǎng)價值相比，榴蓮中槲皮素、咖啡酸、香豆酸、肉桂酸含量較山竹和蛇果高［6］。而果皮也可作為一種附加值具有相應(yīng)的作用。有些水果的果皮甚至比果肉的營養(yǎng)豐富。榴蓮皮中含有多種保健功效的活性成分，榴蓮殼中的多糖凝膠能夠提高肉雞的免疫能力，同時能降低雞肉的膽固醇含量［7］;榴蓮殼醇提物對拘束負荷誘發(fā)小鼠應(yīng)激性肝損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與清除自由基和減少拘束負荷小鼠氧化應(yīng)激水平有關(guān)［8］;陳純馨等［9］在模擬人胃液條件下，研究了榴蓮殼提取液對N，N－二甲基亞硝胺體外合成的阻斷作用，其最大阻斷率可達82.15%。雖然，后兩個研究沒有說明榴蓮皮中的哪種成分具有此功效，但可以證明榴蓮皮中含有多種生物活性成分。因此，開發(fā)和利用榴蓮皮中生物活性物質(zhì)是榴蓮殼得到充分利用的有效途徑之一。從目前的研究現(xiàn)狀來看，研究主要集中在榴蓮果肉方面，而對榴蓮果皮的研究還很少見，尤其對榴蓮果皮中黃酮提取的研究還未見報道，有待于進一步研究。本工作利用超聲波乙醇浸提法提取榴蓮皮中的總黃酮，采用五因素二次通用旋轉(zhuǎn)實驗設(shè)計，研究乙醇濃度、配料比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率對榴蓮皮中黃酮的提取量的影響，確定各因素的最優(yōu)水平，為新產(chǎn)品的開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)提供理論參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金枕榴蓮 購于安徽省合肥市大潤發(fā)超市;蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、正丁醇、氧化鈉、三氯化鋁、鹽酸、氨水、鎂粉、乙酸鎂粉、冰醋酸、醋酸乙酯 均為分析純。

KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;DZ220/4－1型真空干燥箱 南京實驗儀器廠;DHG－9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計

北京普析通用儀器有限公司;DL－5－B離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠制造;ZN－08粉碎機 北京興時利和科技發(fā)展有限公司;RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 新鮮榴蓮皮用蒸餾水沖洗干凈，切片，放入烘箱60℃烘干。烘干后的榴蓮皮用粉碎機粉碎過40目篩備用。

1.2.2 黃酮提取工藝 榴蓮皮干粉→按料液比加入不同濃度的乙醇→在一定的超聲溫度、時間、功率下提取→3600r/min離心20min→收集上清液→在4℃冰箱中醇沉12h→過濾→濃縮→真空干燥→測定黃酮含量

1.2.3 黃酮類物質(zhì)定性檢驗［10］氨顯色反應(yīng):將榴蓮皮提取溶液滴于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，觀察顏色變化;鐵鹽反應(yīng):向榴蓮皮提取溶液中滴加醋酸鉛和氯化鐵水溶液，觀察顏色變化;鋁鹽反應(yīng):向榴蓮皮提取溶液中加入1%三氯化鋁溶液，觀察顏色變化，在300～800nm波長范圍內(nèi)測定色素溶液加入三氯化鋁溶液后的吸光度。

1.2.4 黃酮含量測定［11］標準曲線繪制:稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標準品10mg，加入70%乙醇適量，置于100mL容量瓶中，水浴加熱至溶解，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度。搖勻，準確吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于 10mL 具塞試管中，加30%的乙醇使成5mL，先加5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻，靜置6min，然后加10%Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻，靜置6min，最后再加4%NaOH溶液2mL，搖勻，于510nm波長處測定吸光度A，繪制標準曲線。

根據(jù)標準曲線的制作方法，以濃度(C，mg/mL)為橫坐標，吸光值(A，510nm)為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程:Y=1.3453X－0.0010，r=0.9997。

樣品含量測定:準確吸取200μL樣液測定，方法同標準曲線。

黃酮提取量計算:黃酮提取量(mg/g)=C1×V1/(V2×W)

其中:C1:樣液濃度(mg/g);V1:樣液總體積(mL);V2(mL):測定用樣液體積;W(g):樣品質(zhì)量

1.2.5 榴蓮皮中總黃酮提取條件的初步確定 利用單因素實驗設(shè)計對榴蓮皮醇溶液在超聲波提取條件下的料液比、乙醇濃度、溫度、時間、超聲功率進行初步確定。

1.2.6 響應(yīng)面法組合設(shè)計 以影響榴蓮皮中黃酮含量提取的乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、溫度(X3)、時間(X4)以及超聲功率(X5)為5個實驗因子，以榴蓮皮醇提液中的黃酮提取量(Y)為目標，做五因素的響應(yīng)面組合設(shè)計，共計36個實驗點，用以確定提取榴蓮皮中黃酮的最優(yōu)工藝組合條件，見表1。

表1 五因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計編碼表

1.2.7 驗證實驗與回收率計算 依據(jù)優(yōu)化實驗所得模型方程，取值進行驗證實驗，進行可靠性分析。

精密量取一定濃度的樣品液2.00mL，加入標準蘆丁對照品2.00mL(0.10 mg/mL)，同前樣品測定方法操作測定吸光度，求出回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類物質(zhì)定性鑒定結(jié)果

2.1.1 氨顯色反應(yīng) 將榴蓮皮乙醇提取液滴于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，立刻產(chǎn)生深黃色，當濾紙放置久后，因氨的揮發(fā)而褪色，這是黃酮類化合物的典型反應(yīng)。

2.1.2 鐵鹽反應(yīng) 向榴蓮皮乙醇提取液中加入氯化鐵溶液后，生成了墨綠色的沉淀，放置一段時間溶液的顏色基本褪去，這也是黃酮類物質(zhì)的典型反應(yīng)。

2.1.3 鋁鹽反應(yīng) 向榴蓮皮乙醇提取液中加入1%三氯化鋁溶液，有一種黃色可溶性物質(zhì)生成，可使溶液吸光度增大，說明有黃酮類物質(zhì)存在。

2.2 單因素超聲波提取榴蓮皮中黃酮條件的確定

2.2.1 乙醇濃度對提取榴蓮皮中黃酮含量的影響從圖1中可以看到，乙醇濃度從40%增加到60%時，總黃酮的提取率迅速提高，乙醇濃度在60%～80%時，提取率趨于平緩，當提高乙醇濃度到95%時，提取率明顯下降，反倒不利于提取。所以選擇50%～80%的乙醇濃度較為適宜。

圖1 乙醇濃度對榴蓮皮中黃酮含量的影響

2.2.2 料液比對提取榴蓮皮中黃酮含量的影響 如圖2所示，榴蓮皮中黃酮含量隨著料液比的增大而逐漸增大，當料液比達到1∶25后，黃酮含量增加量趨于平緩。一般來說，溶劑用量少，提取可能會不完全，溶劑用量越大溶解能力越強濃度差越大，溶液也不會達到飽和，因此越有利于黃酮化合物的擴散，提取效果越好。但溶劑用量太大，達到提取完全所需要的時間會相應(yīng)增長，同時浸出的黃酮對未浸出的黃酮有協(xié)同浸提作用，且大量的溶劑會對后續(xù)的濃縮等操作帶來不變。因此，綜合考慮提取效率、生產(chǎn)成本及總黃酮進一步處理的復(fù)雜性，確定超聲波法提取黃酮物質(zhì)料液比較適宜的范圍為1∶12～1∶30。

圖2 料液比對榴蓮皮中黃酮含量的影響

2.2.3 溫度對提取榴蓮皮中黃酮含量的影響 從圖3可以看到，當乙醇回流提取溫度從40℃增加至70℃時，榴蓮皮醇提液中黃酮提取率顯著提高，而隨著溫度的進一步增加，提取率卻逐漸減小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是:溫度升高能使植物組織軟化，促進膨脹，增加可溶性成分的溶解和擴散速度。加熱溫度越高，溶劑的粘度越小，植物有效成分的擴散速度越快。而且溫度適當升高，可使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固破壞，殺死微生物，有利于浸出物的穩(wěn)定性。但由于植物有效成分大多是不耐熱的，生物活性極易受到破壞，過高的浸取溫度會使之分解、變質(zhì)或揮發(fā)散失［12］。另外，隨著加熱溫度的升高，不僅是有效成分傳質(zhì)被加強，而且雜質(zhì)浸出的也相應(yīng)增多，也會影響提取效果。所以認為對于超聲回流法提取榴蓮皮中總黃酮，70℃是一個分界溫度，繼續(xù)提升，會出現(xiàn)不利于提取的現(xiàn)象。

圖3 溫度對榴蓮皮中黃酮含量的影響

2.2.4 時間對提取榴蓮皮中黃酮含量的影響 如圖4可知，黃酮含量隨著時間的延長，提取率先增加后又逐漸降低。曾里等［13］提取元寶楓黃酮時，也發(fā)現(xiàn)超聲處理一定時間后，提取率不再上升，而是出現(xiàn)下降趨勢。超聲波作用時間對提取率的影響和植物的特定種類有關(guān)，隨著作用時間的延長，提取率先增加后下降;原因可能是在長時間作用下，黃酮化合物發(fā)生降解、或是雜質(zhì)含量增加，有效成分含量下降，甚至是溶劑揮發(fā)引起溶劑濃度下降;從而引起提取率的降低。故選擇時間為20～60min。

圖4 時間對榴蓮皮中黃酮含量的影響

2.2.5 超聲功率對提取榴蓮皮中黃酮含量的影響如圖5所示，超聲功率在小于175W時，黃酮提取率呈上升趨勢，當超聲功率大于175W時，黃酮提取率下降。從圖中我們可以看出，超聲功率在100～200W變化時，提取的黃酮含量均能達到20mg/g以上，為了更好的評價超聲功率的影響，故作二次通用旋轉(zhuǎn)實驗，選擇超聲功率范圍為100～200W。

圖5 超聲功率對榴蓮皮中黃酮含量的影響

2.3 二次通用旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計實驗結(jié)果及其模型分析與檢驗

2.3.1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計模型建立與檢驗 實驗結(jié)果見表2。

表2 榴蓮皮中黃酮提取的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗結(jié)果

利用SAS軟件9.0處理數(shù)據(jù)，按照27個實驗結(jié)果計算出所擬合的回歸方程的各項系數(shù)，從而得到如下的標準化二次回歸模型:

由表3可知，二次回歸模型的F=12.4422，大于F0.01(20，14)=3.37，P ＜0.01，說明模型方程差異極顯著;失擬項的 F=0.754992，小于 F0.05(6，9)=3.37，說明差異不顯著，方程擬合效果較好;回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9431，說明該模型能解釋94.31%響應(yīng)值的變化，因此可以用該模型分析超聲波提取時各個變量組合對提取榴蓮皮中黃酮含量的影響。另外，回歸方程的一次項和二次項均差異極顯著(P＜0.01)，方程的交互項差異不顯著(P＞0.05)。由于二次項達到了差異顯著，交互項之間的微弱作用原則上是不能忽略的［14］，所以沒有對模擬方程進行剔除不顯著項。

表3 回歸方程方差分析表

2.3.2 模型分析

2.3.2.1 因素主效應(yīng)分析 榴蓮皮中黃酮提取率受到多種因素的綜合影響，確定對得率起重要作用的主要因素對提高黃酮得率是很重要的。由于各因素處理均經(jīng)無量綱線性編碼代換，偏回歸系數(shù)已經(jīng)不受因素取值的大小和單位的影響即已標準化，其絕對值的大小直接反映了變量對響應(yīng)值的影響程度［15］。因此，根據(jù)表4可知，各因素在實驗取值范圍內(nèi)對提取率的影響順序依次為:X2＞X1＞X3＞X5＞X4，即液料比＞乙醇濃度＞溫度＞超聲功率＞時間。

2.3.2.2 各因子交互作用分析 由于僅有乙醇濃度(X1)和料液比(X2)之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，所以沒有對其它因子的不顯著交互作用分析。如表4所示，為了觀察兩個因素同時對榴蓮皮黃酮含量的影響，可以進行降維分析。令其中三個因素的水平為0，就可得到另外兩個因素對榴蓮皮中黃酮提取含量的影響。

當乙醇濃度一定時，提高料液比可使榴蓮皮中黃酮提取量不斷增加。當料液比一定時，提高乙醇濃度會降低黃酮的提取量。這可能與乙醇的極性有關(guān)系，當乙醇濃度增加時極性減弱，影響了榴蓮皮中黃酮的溶解性，從而使提取量降低。當乙醇濃度為50%～70%，料液比在18∶1以上時，黃酮提取率可到達20mg/g以上。

表4 二次回歸模型參數(shù)

2.3.2.3 最佳工藝參數(shù)優(yōu)化 根據(jù)SAS軟件所建立的數(shù)學(xué)模型進行計算機模擬參數(shù)最優(yōu)化分析(見表5)，獲得最高總黃酮提取量所需的參數(shù)條件為:乙醇濃度為50%，料液比為30∶1，超聲溫度為47℃，超聲時間為 40min，超聲功率為 200W，提取含量為30.7088mg/g。對此方案進行實驗驗證，在此條件下，榴蓮皮醇提液提取總黃酮含量為30.0046mg/g即提取率為3.00046%，其烘干粉中黃酮含量約為26%，回收率為100.09%。驗證結(jié)果與優(yōu)化方案的理論值比較接近，表明本實驗結(jié)果擬合得出的回歸方程可以較好地應(yīng)用于榴蓮皮醇提液中黃酮的提取。

表5 榴蓮皮中黃酮提取量的優(yōu)化

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法對榴蓮皮中總黃酮的提取工藝優(yōu)化，應(yīng)用最佳組合方案后，總黃酮含量可達到30.0046mg/g，回收率為100.09%。符合工業(yè)化生產(chǎn)的需要，為新產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論參數(shù)。

近年來，世界上掀起了植物源開發(fā)的熱潮，植物源以其天然低毒的特點倍受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人注目。榴蓮皮作為一種廢棄物質(zhì)而廣泛存在，實驗結(jié)果表明，榴蓮皮中含有較為豐富的黃酮。因此，榴蓮皮具有廣泛的開發(fā)和利用價值，值得綜合利用，應(yīng)加強資源開發(fā)。

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Optimization of extraction of total flavonoids from durian shell by response surface methodology

LI Na，DONG Ming*，ZHANG Guo－qing，YU Ya－qiong

(College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

Study on the assistance by ultrasonic ethanol extraction technology，the raw materials of durian shell was studied to extraction of the total flavonoids by response surface designs.Through single－factor and response surface experiments，established two regression equations that durian shell total flavonoids content and five varietals factors.At the same time we carried out the computer simulation results and drawing surface base on the regression model，ensured the direction of changes and optimizations of two main factors for the durian shell flavonoids content，and verified the extracted flavonoids.Results indicated that:the alcohol concentration for 50%，

liquid－to－solid ratio of 30∶1，ultrasonic temperature 47℃，ultrasound time 40min，ultrasonic power was 200W.Under these conditions the total flavonoids obtained from durian shell was 30.0046mg/g and the rate of recovery could reach 100.09%.

durian shell;flavonoids;RSM;ultrasonic

TS255.1

B

1002－0306(2011)09－0325－05

2010－09－19 *通訊聯(lián)系人

李娜(1984－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。