哈蟆油水溶性總蛋白抗疲勞活性的研究

張 梅，趙 雨，*，李蕓彤，幺寶金，曲曉波

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春130117;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021)

哈蟆油水溶性總蛋白抗疲勞活性的研究

張 梅1，趙 雨1，*，李蕓彤1，幺寶金2，曲曉波1

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春130117;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021)

研究了哈蟆油水溶性總蛋白的抗疲勞藥理活性。采用中性緩沖液浸提，硫酸銨沉淀法制備哈蟆油水溶性總蛋白。設(shè)立哈蟆油水溶性總蛋白低、中、高三個(gè)劑量組(0.075、0.15、0.30g/kg)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，小鼠灌胃給藥30d。觀察小鼠體重、負(fù)重游泳時(shí)間、尿素氮含量、肝糖原含量、血乳酸含量等指標(biāo)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哈蟆油水溶性總蛋白可延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，降低血清尿素氮含量，顯著增加肝糖原含量，顯著降低血乳酸含量，對(duì)小鼠的體重?zé)o明顯影響。證明了哈蟆油水溶性總蛋白具有一定的抗疲勞作用。

哈蟆油，水溶性總蛋白，抗疲勞

哈蟆油(Oviductus Ranae) ，為中國(guó)林蛙雌蛙的輸卵管，具有益精補(bǔ)腎、滋陰養(yǎng)顏、延緩衰老、增強(qiáng)人體免疫力之功效，臨床上用于陰虛體弱，神疲乏力，咳嗽咳血等癥［1－2］。1940 年壽田 文 次郎等日本學(xué)者［3］，對(duì)產(chǎn)于吉林的哈蟆油進(jìn)行了化學(xué)成分研究，結(jié)果表明哈蟆油的成分主要為蛋白質(zhì)。90年代，范玉林［4］等對(duì)哈蟆油蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步測(cè)定，結(jié)果表明哈蟆油中總蛋白含量為48.51%～51.23%，其中水溶性蛋白含量為13.33%。目前，哈蟆油的藥理研究主要以整體藥材為研究對(duì)象，對(duì)其主要成分蛋白質(zhì)的藥理研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取從哈蟆油中分離提取得到的水溶性總蛋白，就其抗疲勞生物活性進(jìn)行了探討，為哈蟆油系列產(chǎn)品研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈蟆油 購(gòu)于吉林省白山市北亞藥業(yè)，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為中國(guó)林蛙(Rana temporaria chensinensisDavid)雌蛙的干燥輸卵管;SPF級(jí)BALB/C種雄性小鼠 體重為(20±2)g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;磷酸氫二鈉、二乙酰肟、蒽酮 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

中空纖維膜過(guò)濾系統(tǒng) GE Healthcare;722N型分光光度計(jì) 上海尤尼柯有限公司;DS－1型組織勻漿器 上海正慧工貿(mào)有限公司;HH.S21－8－S型恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;TDL－5－A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;LL3000型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Heto公司;游泳箱 50cm×40cm×35cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哈蟆油水溶性總蛋白的制備［5］pH為6.5的20mmol/L磷酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液(含0.5mol/L的氯化鈉)，在料液比1∶200的條件下浸提3次，4500r/min離心20min，取其上清，經(jīng)中空纖維膜過(guò)濾澄清(0.45μm)，80% 硫酸銨沉淀，4500r/min離心20min，取其沉淀透析 24h，4500r/min 離心 20min，取其上清，真空冷凍干燥，凍干品即為水溶性總蛋白，蛋白收率為 9.96%，folin－酚法測(cè)定蛋白純度為86%。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥劑量 小鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組(同體積蒸餾水)、哈蟆油水溶性總蛋白(低、中、高)3個(gè)劑量組，灌胃劑量分別為0.075、0.15、0.30g/kg，相當(dāng)于人體劑量的 2.5、5、10 倍。每天灌胃一次，連續(xù)30d。灌胃期間飼喂合成鼠料，自由攝食、飲水，溫度(22±1)℃。

1.2.3 體重及負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 測(cè)量小鼠實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中(4d/次)及實(shí)驗(yàn)終期的體重。末次給予受試樣品30min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深約30cm，水溫(25±1)℃，記錄小鼠自游泳開(kāi)始至死亡的時(shí)間，即為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

1.2.4 血清尿素氮測(cè)定 末次給予受試樣品30min后，在溫度為30℃的水中不負(fù)重游泳90min，休息60min后立即拔眼球采血0.5mL(不加抗凝劑)，置4℃冰箱約3h，血凝固后2000r/min離心15min，取血清50μL，采用二乙酰－肟法［6］測(cè)定血清尿素氮含量。

1.2.5 肝糖原測(cè)定 末次給予受試樣品30min后處死小鼠，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟 100mg，加 8mL三氯醋酸，勻漿 1min，3000r/min離心15min，取上清液用蒽酮法［6］測(cè)定肝糖原含量。

1.2.6 血乳酸測(cè)定 末次給予受試樣品30min后，從內(nèi)眥靜脈叢采血20μL，然后不負(fù)重在30℃的水中游泳10min后停止，分別于運(yùn)動(dòng)后0、20min同上采血20μL，測(cè)定血乳酸含量［6］。計(jì)算血乳酸曲線下面積，血乳酸曲線下面積=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min的血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與結(jié)果判定 采用SPSS13.0軟件，通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為±s，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠體重的影響

哈蟆油水溶性總蛋白各劑量組小鼠實(shí)驗(yàn)初始、中期、終末的體重與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及血清尿素氮含量的影響

由表1可見(jiàn)，哈蟆油水溶性總蛋白各實(shí)驗(yàn)組負(fù)重游泳時(shí)間均比對(duì)照組延長(zhǎng)，但均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各劑量組血清尿素氮含量均比對(duì)照組降低，但均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。表明哈蟆油水溶性總蛋白延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和降低小鼠尿素氮含量的作用不顯著。

表1 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及血清尿素氮含量的影響(n=15±s)

表1 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及血清尿素氮含量的影響(n=15±s)

組別 游泳時(shí)間(min)血清尿素氮(BUN)(mmol/L)空白對(duì)照組13.4±3.4 11.3±0.52 8.0±2.5 11.9±0.78低劑量組 9.4±3.1 11.7±0.56中劑量組 10.6±3.2 11.7±0.49高劑量組

2.3 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠肝糖原含量的影響

由表2可見(jiàn)，哈蟆油水溶性總蛋白各劑量組肝糖原含量均比對(duì)照組升高，且低、中劑量組具有顯著性差異(P＜0.05)。表明哈蟆油水溶性總蛋白能顯著增加小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原儲(chǔ)備量。

表2 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠肝糖原含量的影響(n=15±s)

表2 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠肝糖原含量的影響(n=15±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 肝糖原含量(mg/100g肝)空白對(duì)照組4792.82±202.50低劑量組 596.51±193.24*中劑量組 5632.08±191.19*高劑量組4870.53±196.71

2.4 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)血乳酸含量的影響

由表3可見(jiàn)，小鼠游泳前，哈蟆油水溶性總蛋白實(shí)驗(yàn)組各劑量組血乳酸值與對(duì)照組比較明顯降低，差異非常顯著(P＜0.01);游泳10min后，各劑量組血乳酸值均比對(duì)照組降低，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05);游泳10min休息20min后，各劑量組血乳酸值與對(duì)照組比較明顯降低，且低劑量組差異顯著(P＜0.05)，中、高劑量組差異非常顯著(P＜0.01);各劑量組的乳酸曲線下面積與對(duì)照組相比明顯降低，且低劑量組差異顯著(P＜0.05)，中、高劑量組差異非常顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明，哈蟆油水溶性總蛋白能顯著降低小鼠血乳酸的含量。

3 討論

在長(zhǎng)時(shí)間較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，血清尿素氮的變化范圍明顯，血清尿素氮與機(jī)體機(jī)能、疲勞程度以及負(fù)荷量的大小呈密切正相關(guān)關(guān)系，可用來(lái)作為評(píng)定運(yùn)動(dòng)量的指標(biāo)［7］。一旦肝糖原耗竭引起血糖水平下降而使運(yùn)動(dòng)肌供能不足，將導(dǎo)致外周疲勞，同時(shí)由于體內(nèi)糖貯量下降或過(guò)度消耗，血糖濃度下降，中樞系統(tǒng)能量供應(yīng)受影響，產(chǎn)生中樞疲勞，所以肝糖原貯量對(duì)維持長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)血糖濃度起重要作用［8］。減少乳酸的產(chǎn)生或加快乳酸的消除，都可延緩疲勞發(fā)生或加速疲勞的消除，血乳酸水平可以反映有氧代謝能力、疲勞的產(chǎn)生和消除速度［9］。

表3 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠血乳酸含量的影響(n=15±s)

表3 哈蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠血乳酸含量的影響(n=15±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

血乳酸曲線下面積空白對(duì)照組別 全血LAC含量(mmol/L)泳前 泳后0min 泳后20min＊＊2.49±1.06 1.63±0.73 1.13±0.46 48.11±18.79低劑量組 1.05±0.43＊＊ 1.20±0.41 0.75±0.27* 31.01±9.18*中劑量組 0.89±0.40＊＊ 1.35±0.47 0.67±0.28＊＊ 31.58±9.51＊＊高劑量組 1.46±0.44＊＊ 1.23±0.43 0.72±0.24＊＊ 33.06±9.96

本研究首先通過(guò)負(fù)重游泳持續(xù)時(shí)間直接觀察到了哈蟆油水溶性總蛋白能延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間，然后通過(guò)測(cè)定尿素氮、肝糖元和血乳酸相關(guān)的生化指標(biāo)，研究了哈蟆油水溶性總蛋白的抗疲勞作用。結(jié)果表明:低、中劑量組小鼠肝糖原含量明顯高于對(duì)照組，具有增強(qiáng)機(jī)體肝糖原儲(chǔ)備的作用;各劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后的血乳酸曲線下面積均小于對(duì)照組，具有延緩疲勞發(fā)生或加速疲勞消除的作用;各劑量組降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮含量的作用不明顯。證明哈蟆油水溶性總蛋白具有一定的抗疲勞作用，本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用哈蟆油水溶性總蛋白奠定了基礎(chǔ)。

［1］劉玉蘭，牟孝碩，崔素玉.蛤蟆油的抗衰老作用［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，15(1):56.

［2］劉玉蘭，姜云梅，尤越人.蛤蟆油及其提取物對(duì)腎虛和正常小鼠的抗疲勞作用［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，14(1):20.

［3］Jiu BTQG.About oviductas ranae research on oviductas ranae oral［J］.Japanese Med Anal，1934，18:39.

［4］范玉林，崔香順，姚玉霞.哈士蟆油成分研究的進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，18(3):105－107.

［5］劉思超，趙雨，張梅，等.哈蟆油總蛋白提取工藝［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30:19－21.

［6］保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范［S］.2003:87－93.

［7］劉育京.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科傘書(shū).消毒、殺蟲(chóng)、滅鼠［M］.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，1982.

［8］魏守剛，孫廷瑩.糖與耐力運(yùn)動(dòng)［J］.山東體育科技，1996，69(18):58－60.

［9］張肅，胡春曉，金莉莉，等.東北林蛙卵蛋白抗疲勞活性研究［J］.特產(chǎn)研究，2010，47(1):7－9.

Study on the anti－fatigue function of water－miscible total proteins from Oviductus Ranae

ZHANG Mei1，ZHAO Yu1，*，LI Yun－tong1，YAO Bao－jin2，QU Xiao－bo1

(1.Center for New Medicine Research of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China)

The pharmacological activity of water－miscible total proteins from Oviduetus Ranae was studied.Prepared water－miscible total proteins by neutral buffer extraction and ammonium sulfate precipitation.Low，medium，high(0.075，0.15，0.30g/kg)dose of water－miscible total proteins and a blank dose had been applied to mice for 30d continuously.The change of body weight of mice，swimming time，urea nitrogen，hepatic glycogen，and blood lactic acid content were observed.The results showed that the water－miscible total proteins of Oviductus Ranae could extend the swimming time of mice，significantly increase liver glycogen contents，significantly lower blood lactate levels，and had no significant effect on body weight of mice.The results proved the water－miscible total proteins of Oviductus Ranae had anti－fatigue effect.

Oviductus Ranae;water－miscible total proteins;anti－fatigue

TS201.4

A

1002－0306(2011)11－0417－03

2010－11－15 *通訊聯(lián)系人

張梅(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

國(guó)家“十一五”科技支撐項(xiàng)目(2007BAI38B06)。