凝膠色譜法測(cè)定法羅培南鈉顆粒高分子雜質(zhì)的含量

楊 娜，鞏麗萍，王維劍，丁 勃

(山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250101)

法羅培南(fampenem)是1997年投放市場(chǎng)的第1個(gè)青霉烯類抗生素，對(duì)各種β－內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對(duì)厭氧革蘭陽(yáng)性菌及多數(shù)革蘭陰性菌的抗菌活性均等同于或優(yōu)于頭孢菌素及青霉素類抗生素［1］.目前，在各國(guó)藥典中，僅《日本藥典》中有收載，但未列高分子雜質(zhì)檢查項(xiàng)目.因法羅培南是一種臨床上常用的β－內(nèi)酰胺類抗生素.經(jīng)多年研究證明，β－內(nèi)酰胺類抗生素所致的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)并非藥物本身所致，是和此類藥物中存在的高分子雜質(zhì)有關(guān)，故建立其法羅培南聚合物含量的測(cè)定方法，以更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量.

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀:G1310A單元泵;G1314A檢測(cè)器;CAG Bootp Server程序.

1.2 藥品與試劑 法羅培南鈉對(duì)照品(批號(hào):090401，含量:81.1%，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司);法羅培南鈉顆粒 (批號(hào)090601，090602，090603，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，規(guī)格200 mg).葡聚糖凝膠G－10(進(jìn)口)、藍(lán)色葡聚糖2000、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:自制葡聚糖凝膠G－10(不銹鋼內(nèi)徑為1.3 cm，柱高度為40 cm)色譜柱;流動(dòng)相A為pH7.0的0.1 mol·L 磷酸鹽緩沖液［0.1 mol·L 磷酸氫二鈉 －0.1 mol·L磷酸二氫鈉)(61∶39)］，流動(dòng)相 B 為水;流速:1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm，進(jìn)樣量 100 μL.取 0.1mg·ml－1藍(lán)色葡聚糖2000溶液100 μL注入液相色譜儀，分別以流動(dòng)相A、B為流動(dòng)相測(cè)定，記錄色譜圖.理論板數(shù)按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算均應(yīng)不低于700，拖尾因子均應(yīng)小于2.0.在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰保留時(shí)間的比值應(yīng)在0.93～1.07之間.稱取法羅培南鈉對(duì)照品12.36 mg，置200 mL量瓶中，用0.1 mg·mL－1的藍(lán)色葡聚糖2000溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻.量取100 μL注入液相色譜儀，以流動(dòng)相A進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖.高聚體的峰高與單體與高聚體之間的谷高比應(yīng)大于2.0.另以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，精密量取對(duì)照溶液100 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 5.0%［2］.

2.2 檢測(cè)限與定量限的測(cè)定 取法羅培南鈉對(duì)照品，用水制成每1 mL含法羅培南鈉24.59 μg的溶液，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相，精密量取100 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時(shí)峰高約為基線噪音的3倍(S/N約為3)，據(jù)此計(jì)算本品檢測(cè)限為 2.46 μg，定量限為 8.2 μg.

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 葡聚糖2000溶液的制備 用水制成每1 mL含葡聚糖2000 0.1 mg的溶液.

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取法羅培南鈉對(duì)照品13.54 mg，置200 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.3.3 供試品溶液的制備 取法羅培南鈉顆粒(平均裝量為 1.872 2 g，規(guī)格為 0.2 g)2.405 6 g，置 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.3.4 分離度溶液的配制 取法羅培南鈉顆粒適量，用0.1 mg·L－1藍(lán)色葡聚糖2000溶液溶解稀釋制成每1 mL含法羅培南 512.55 μg，量取 100 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖見圖1.藍(lán)色葡聚糖2000與供試品主峰達(dá)到有效分離.保留時(shí)間表示流動(dòng)相流速確定條件下的Kav=0的洗脫時(shí)間，即相當(dāng)于被排阻的聚合物洗脫的保留時(shí)間，法羅培南鈉聚合物的峰與藍(lán)色葡聚糖的峰重疊，保留時(shí)間一致.

2.4 對(duì)照品溶液的線性和范圍 精密稱取法羅培南鈉對(duì)照品10.06 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用.分別取 100、88、75、62.5、50、25、12.5 和 6.25 μL 進(jìn)樣，記錄色譜峰(圖2).

圖1 法羅培南鈉顆粒與葡聚糖2000色譜圖

圖2 法羅培南對(duì)照品色譜圖

圖3 法羅培南鈉顆粒色譜圖

表1 對(duì)照品溶液的線性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

結(jié)論:法羅培南鈉對(duì)照品溶液5.1 ～81.6 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.5 供試品濃度與聚合物峰面積的線性和范圍 精密稱取法羅培南鈉顆粒2.580 4 g(相當(dāng)于法羅培南0.275 7 g)，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用.分別取100、80、60、40、20 和 10 μL 進(jìn)樣，記錄色譜峰(圖 3).

表2 供試品溶液濃度與聚合物峰面積的線性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

結(jié)論:供試品溶液在55.14 ～551.40 mg·mL－1范圍內(nèi)與法羅培南鈉聚合物峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.6 F值的穩(wěn)定性試驗(yàn) 照2.4配制法羅培南鈉對(duì)照品溶液(50.931 μg·L－1)，在室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，24 h取樣，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，其法羅培南鈉峰面積分別為:3 885.193、3 886.425、3 853.446、3 797.703、3 798.836、3 788.945，計(jì)算F值(法羅培南鈉對(duì)照品濃度/與主峰面積比值).

表3 F值的重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 法羅培南鈉聚合物含量測(cè)定 取供試品照2.3.3配制供試品溶液;取2.4配制法羅培南鈉對(duì)照品溶液(50.931 μg·L－1)，照2方法與結(jié)果的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4.

表4 樣品法羅培南鈉聚合物的含量測(cè)定

3 討論

3.1 本方法是利用凝膠色譜分子篩機(jī)制，讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)被排阻不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，在色譜過(guò)程不被保留，最早被流動(dòng)相洗脫至柱外，表現(xiàn)為在Kav=0處流出.

實(shí)驗(yàn)表明，在特定條件下，β－內(nèi)酰胺類抗生素可以締合形式表現(xiàn)分子量較大的締合物，締合物在Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜行為和高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav=0處，表現(xiàn)為單一的色譜峰.按色譜條件對(duì)相關(guān)保留時(shí)間進(jìn)行比較，確定供試品色譜圖中Kav=0處的峰即為聚合物峰.

3.2 采用自身對(duì)照外標(biāo)法以法羅培南鈉對(duì)照品為對(duì)照，測(cè)定其在特定條件下締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)，在改變色譜條件，測(cè)得供試品中的高分子雜質(zhì)峰響應(yīng)指標(biāo).方法簡(jiǎn)便、快速，且自身對(duì)照外標(biāo)法無(wú)需專門制備標(biāo)準(zhǔn)品又可同外標(biāo)法一樣精確對(duì)高分子雜質(zhì)峰進(jìn)行定量，結(jié)果直觀.

3.3 對(duì)一個(gè)廠家3批次的法羅培南鈉顆粒分別進(jìn)行高分子雜質(zhì)測(cè)定，用自身對(duì)外標(biāo)法進(jìn)行定量.三批法羅培南鈉顆粒含量在0.13% ～0.14%范圍.

［1］趙霞，胡昌勤，金少鴻.法羅培南鈉中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的建立［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(5):68 －70.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010版(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2010.