甲殼素超微粉碎輔助制備D-氨基葡萄糖鹽酸鹽

朱興一，張玉燕，謝 捷，王 平

(浙江工業(yè)大學藥學院，制藥工程教育部重點實驗室，浙江杭州 310014)

甲殼素超微粉碎輔助制備D-氨基葡萄糖鹽酸鹽

朱興一，張玉燕，謝 捷，王 平*

(浙江工業(yè)大學藥學院，制藥工程教育部重點實驗室，浙江杭州 310014)

研究了甲殼素超微粉碎輔助制備D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(GAH)的工藝。對HCl濃度、反應時間、反應溫度和液料比進行單因素考察，根據(jù)考察結果進行Box－Benhnken中心組合設計，利用響應面分析法優(yōu)化工藝參數(shù)，然后進行驗證實驗，并將該工藝條件與傳統(tǒng)GAH制備工藝比較。結果表明，甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的較佳工藝為:HCl濃度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反應時間3.6h、反應溫度83.0℃。此條件下GAH得率為74.82%，與理論值基本相符。與傳統(tǒng)制備工藝相比，新工藝反應條件更加溫和，同時GAH得率提高了14.77%。

甲殼素，超微粉碎，D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(GAH)，響應面分析

甲殼素是一種自然界大量存在的可再生的天然生物高分子聚合物，主要組成單位是N－乙酰－D－氨基葡萄糖。在鹽酸中，甲殼素水解生成D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(D－Glucosamine hydrochloride，GAH)。GAH性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗炎、抗氧化、防腐、抗菌、抗腫瘤等多種作用，同時也是合成有關藥物的重要原料，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工等領域［1－4］，其需求量日益增加。超微粉碎技術是為適應現(xiàn)代技術要求而發(fā)展起來的一種新的粉碎技術，能把原材料加工成微米甚至納米級的微粉。經(jīng)超微粉碎的物料，具有一般顆粒所不具有的特殊理化性質(zhì)，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化學反應活性等［5－7］。超微粉碎技術被廣泛應用到食品、中藥、農(nóng)產(chǎn)品等領域中［8－11］，其發(fā)展前景廣闊。本文探討甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的工藝，通過單因素考察和響應面分析，確定較佳工藝條件，并與傳統(tǒng)GAH制備方法進行比較，以期提供一種高效制備GAH的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼素 片狀，浙江新復大醫(yī)藥化工有限公司;濃鹽酸、無水乙醇 分析純;粉末狀活性炭 化學純。

DZF真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;RE－52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠; AGO－2型高能行星球磨機 俄羅斯;WZZ－1旋光儀

上海物理光學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 GAH制備工藝

1.2.1.1 甲殼素超微粉碎輔助制備GAH工藝 取甲殼素原料用AGO－2球磨機進行超微粉碎，過500目篩得到粒徑≤0.025mm的超微粉。準確稱取甲殼素超微粉20.0g，緩慢投入裝有一定濃度HCl溶液的燒瓶中，攪拌條件下緩慢升溫至設定的溫度，水解反應若干小時。反應結束后，過濾，濾液用活性炭脫色，再經(jīng)減壓濃縮、無水乙醇洗滌、70℃干燥得GAH白色晶體。計算產(chǎn)品得率，測定旋光度。

1.2.1.2 傳統(tǒng)制備GAH工藝 準確稱取甲殼素原料

20.0g，緩慢投入裝有一定濃度HCl溶液的燒瓶中，后續(xù)操作過程同前。

1.2.2 GAH得率計算 GAH得率按如下公式計算∶

式中∶m－產(chǎn)品GAH質(zhì)量(g);M－甲殼素質(zhì)量(g)。

1.2.3 旋光度測定 準確稱取0.25g GAH產(chǎn)品，用蒸餾水配制成25mL溶液，20℃下放置10h后，在WZZ－1旋光儀上測定旋光度，計算其比旋光度。

1.2.4 實驗方案的設計

1.2.4.1 單因素實驗 通過預實驗，確定對HCl濃度、反應時間、反應溫度和液料比進行單因素實驗。

1.2.4.2 響應面優(yōu)化實驗 依據(jù)單因素實驗結果，采用Design Expert 7.0軟件建立響應面分析模型，以HCl濃度(X1)、液料比(X2)、反應時間(X3)、反應溫度(X4)為自變量，以+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，GAH的得率(Y)為響應值，設計四因素三水平實驗。實驗因素與水平的取值見表1。

表1 響應面分析因素與水平

2 結果與討論

2.1 單因素實驗及結果

2.1.1 HCl濃度對GAH得率的影響 固定HCl溶液與甲殼素液料比為4∶1(mL∶g)，反應時間為4h，反應溫度為90℃，改變HCl濃度，GAH得率見圖1。由圖1可以看出，當HCl濃度低于6mol/L時，產(chǎn)品得率較低，這是由于低濃度HCl難以水解β－(1，4)糖苷鍵。隨著HCl濃度的升高，水解能力逐漸增強，GAH得率增加。當HCl濃度為8mol/L時，GAH得率最高。HCl濃度繼續(xù)增加時，GAH得率開始下降，這是因為HCl濃度過高，副反應增多，焦化現(xiàn)象嚴重。響應面中心組合實驗選取HCl濃度范圍為6～10mol/L。

2.1.2 HCl溶液與甲殼素液料比對GAH得率的影響

固定HCl濃度為8mol/L，反應時間為4h，反應溫度為90℃，改變HCl溶液與甲殼素的液料比，結果見圖2。液料比低，反應體系黏度增大，反應不充分。液料比提高，甲殼素可充分反應，但用量過多時會出現(xiàn)副反應，GAH得率下降。響應面中心組合實驗選取液料比范圍為3∶1～5∶1(mL∶g)。

圖1HCl濃度對GAH得率的影響

圖2 液料比對GAH得率的影響

2.1.3 反應時間對GAH得率的影響 固定HCl濃度8mol/L，HCl溶液與甲殼素液料比為4∶1(mL∶g)，反應溫度為80℃，改變反應時間，結果見圖3。隨著反應時間延長，GAH得率逐漸提高，當反應達到4h時，得率達到最大值72.23%。時間過短，甲殼素水解不完全，時間過長，副反應嚴重。響應面中心組合實驗選取反應時間范圍為3～5h。

圖3 反應時間對GAH得率的影響

2.1.4 反應溫度對GAH得率的影響 固定HCl濃度為8mol/L，HCl與甲殼素液料比為4∶1(mL∶g)，反應時間為4h，改變反應溫度，GAH得率見圖4。由圖

4可以看出，隨著溫度升高，GAH得率增加，當溫度高于80℃時，GAH得率開始下降。溫度較低時，甲殼素不反應，溫度過高時，易生成低聚糖與非糖物質(zhì)等副產(chǎn)物，同時產(chǎn)品顏色加深，因而應避免高溫，以提高GAH的得率與純度。響應面中心組合實驗選取溫度范圍為70～90℃。

圖4 反應溫度對GAH得率的影響

2.2 響應面分析實驗及結果

根據(jù)Box－Benhnken實驗設計原理，綜合單因素實驗結果，通過Design Expert 7.0軟件，對制備工藝進行響應面分析，建立數(shù)學模型，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對自變量進行編碼，共設立了29個處理組。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。實驗設計與實驗結果如表2所示。各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項回歸方程為∶

表2 Box－Benhnken設計方案及實驗結果

當“Prob＞F”值小于0.05時表示該指標顯著。從表3的分析結果來看，整體模型“Prob＞F”值小于0.0001，表明該二次方程模型高度顯著。R2=0.9840表明模型響應值的變化98.40%來自所選因變量，預測值與實測值之間具有高度的相關性。模型的失擬性方差分析可以看出，失擬項不顯著(P＞0.05)，表明該模型是穩(wěn)定的，能很好地預測實際GAH得率的變化。由表3的F值可知，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素對GAH得率的影響順序為∶HCl濃度＞反應溫度＞液料比＞反應時間。根據(jù)回歸分析結果，得到相應的曲面圖(圖5～圖10)。圖5～圖10直觀地給出了各個因素交互作用的響應面的3D圖和等高線圖。從響應面的最高點和等高線圖可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即是響應面的最高點。等高線圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著。比較幾個圖可以知道，HCl濃度、反應溫度對響應值的影響較大，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結果吻合。

表3 回歸模型方差分析結果

2.3 響應面分析結果驗證

結合回歸模型的數(shù)學分析可知，甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的較佳工藝參數(shù)為∶HCl濃度8.76 mol/L、液料比4.14∶1(mL∶g)、反應時間3.55h、反應溫度82.9℃。為了檢驗響應面法的可行性，對回歸得到的較佳工藝進行驗證實驗。考慮到實際操作的可行性，將較佳工藝條件定為∶HCl濃度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反應時間3.6h、反應溫度83.0℃。實驗重復3次，GAH平均得率為74.82%，與預測值的相對誤差為1%左右。所得產(chǎn)品比旋光度為71.2～72.6°，符合質(zhì)量標準要求(美國藥典∶+70.0～+73.0°)。由此說明，響應面法適用于GAH制備工藝的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化，具有一定的實用價值。

2.4 甲殼素超微粉碎輔助制備工藝與傳統(tǒng)制備工藝比較實驗

對傳統(tǒng)GAH制備進行響應面分析法實驗設計后，得到較佳工藝條件∶HCl濃度10.4 mol/L、液料比4.8∶1(mL∶g)、反應時間4.4h、反應溫度90.2℃。將此工藝與甲殼素超微粉碎輔助制備的較佳工藝進行比較，結果見表4。

表4 微粉碎輔助制備工藝與傳統(tǒng)酸法制備工藝比較

由表4可知，與傳統(tǒng)工藝相比，甲殼素超微粉碎輔助制備工藝降低了HCl濃度、用量及反應溫度，同時縮短了反應時間，GAH得率提高了14.77%，這是

圖5 HCl濃度和液料比對GAH得率影響的響應面圖

圖6 HCl濃度和反應時間對GAH得率影響的響應面圖

圖7 HCl濃度和反應溫度對GAH得率影響的響應面圖

圖8 液料比和反應時間對GAH得率影響的響應面圖

圖9 液料比和反應溫度GAH得率影響的響應面圖甲殼素超微粉碎的特殊作用所致。通過超微粉碎，降低了原料的粉末粒徑，同時增大了表面積，使甲殼素更易于和HCl接觸，從而使反應能在較溫和的條件下進行，避免了因長時間高溫作用引起過度反應形成的焦化現(xiàn)象，保證了產(chǎn)品的高得率和高純度。

圖10 反應溫度和反應時間對GAH得率影響的響應面圖

3 結論

研究了甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的工藝，并用響應面分析法優(yōu)化得到較佳工藝參數(shù)∶HCl濃度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反應時間3.6h、反應溫度83.0℃。此時，GAH的得率為74.82%，與理論值基本相符。與傳統(tǒng)制備工藝相比，新工藝反應條件更加溫和，同時GAH得率明顯提高，為GAH生產(chǎn)工藝的改進起到了一定的參考作用。

［1］陳忻.氨基葡萄糖鹽酸鹽的防腐抗菌作用研究［J］.精細化工，2001，18(2):78－79.

［2］李運曼，唐明月，夏雯，等.D－氨基葡萄糖鹽酸鹽的抗腫瘤作用［J］.中國天然藥物，2003，1(4):237－239.

［3］張?zhí)m杰，侯冬巖，辛廣，等.D－氨基葡萄糖鹽酸鹽的制備及抗氧化特性的研究［J］.食品科學，2007，28(4):103－105.

［4］江相保，高李俠.鹽酸氨基葡萄糖治療膝退行性骨性關節(jié)炎的臨床觀察［J］.中國修復重建外科雜志，2008，22(1): 29－31.

［5］袁惠新，俞建峰.超微粉碎的理論、實踐及其對食品工業(yè)發(fā)展的作用［J］.包裝與食品機械，2001，19(1):5－10.

［6］潘思軼，王可興，劉強.不同粒度超微粉碎米粉理化特性研究［J］.食品科學，2004，25(5):58－62.

［7］蓋國勝，徐政.超細粉碎過程中物料的理化特性變化及應用［J］.粉體技術，1997，3(2):41－42.

［8］鄧雯，夏荃，詹若挺，等.中藥超微粉碎技術的研究進展［J］.食品與藥品，2007，9(11):59－62.

［9］袁惠新，俞建峰，崔政偉，等.超微粉碎技術及其在食品加工中的應用［J］.農(nóng)機與食品機械，1999(5):32－34.

［10］楊珺，鄒全明，王東昕.鱉甲超細粉碎免疫調(diào)節(jié)動物實驗研究［J］.食品科學，2000，21(3):40－42.

［11］張慜，王亮.超微粉碎在食品加工中的研究進展［J］.無錫輕工大學學報，2003，22(4): 106－110.

Superfine comminution assisted preparation of D－Glucosamine hydrochloride from chitin

ZHU Xing－yi，ZHANG Yu－yan，XIE Jie，WANG Ping*
(College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University of Technology，Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering of Ministry of Education，Hangzhou 310014，China)

The operating factors affecting the yield of D－Glucosamine hydrochloride(GAH)from chitin by superfine comminution assisted preparation(SCAP)were studied.Firstly，single factors including HCl concentration，solidliquid ratio，reaction time and reaction temperature were investigated seperately，then the response surface analysis method followed by the verification tests was conducted for obtaining the appropriate operation conditions.Finally，the SCAP method was compared with the traditional preparation method.Results showed that the optimal conditions of GAH preparation were as follow:HCl concentration was 8.8mol/L，liquid－solid ratio was 4.2∶1 (mL∶g)，reaction time was 3.6h and reaction temperature was 83.0℃.Under above conditions，the yield of GAH was 74.82%，which matched with the predicted yield.Compared with the traditional preparation method，the SCAP method had obvious advantages with milder conditions and higher yield.

chitin;superfine comminution;D－Glucosamine hydrochloride(GAH);response surface analysis

TS201.2

B

1002－0306(2011)11－0321－04

2010－09－21 *通訊聯(lián)系人

朱興一(1977－)，男，講師，博士，主要從事天然藥物研究。

浙江省教育廳科研計劃項目(Y200908144);科技部國際科技合作項目(2008DFR40280)。