抑制腫瘤血管新生的復(fù)合肽VBP3局部刺激與全身過敏性實(shí)驗(yàn)*

康艷麗， 王 宏， 向軍儉， 王盼盼， 呂衛(wèi)東， 鄧 寧

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心， 廣東 廣州 510632)

抑制腫瘤血管新生的復(fù)合肽VBP3局部刺激與全身過敏性實(shí)驗(yàn)*

康艷麗， 王 宏， 向軍儉， 王盼盼， 呂衛(wèi)東， 鄧 寧△

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心， 廣東 廣州 510632)

目的評價(jià)抑制腫瘤血管新生的復(fù)合肽VBP3的安全性。方法同體左右側(cè)自身對比法對3 只家兔進(jìn)行皮下注射的局部刺激實(shí)驗(yàn)。28 只豚鼠隨機(jī)分為4組：無菌生理鹽水(PS)陰性對照組6只，牛血清白蛋白(BSA)陽性對照組6只，復(fù)合肽VBP3 低劑量組6只，復(fù)合肽VBP3高劑量組6只，進(jìn)行全身過敏實(shí)驗(yàn)；剩余4只豚鼠，牛血清白蛋白陽性對照組和復(fù)合肽VBP3 高劑量組各2只，不經(jīng)致敏直接心臟激發(fā)。結(jié)果抑制腫瘤血管新生的復(fù)合肽VBP3 對家兔皮下注射的局部刺激反應(yīng)輕微；豚鼠實(shí)驗(yàn)僅復(fù)合肽VBP3高劑量組1只豚鼠出現(xiàn)弱陽性過敏反應(yīng)，且很快緩解，其余豚鼠未見過敏癥狀。結(jié)論抑制腫瘤血管新生的復(fù)合肽VBP3在本實(shí)驗(yàn)條件下安全。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子； 成纖維細(xì)胞生長因子 2； 復(fù)合肽疫苗VBP3

腫瘤生長與其血管新生有非常密切的關(guān)系，是腫瘤增生、擴(kuò)散和微轉(zhuǎn)移灶發(fā)展的重要條件之一， 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是促進(jìn)腫瘤血管生長作用最強(qiáng)的2種關(guān)鍵因子，是誘導(dǎo)血管生成的主要調(diào)節(jié)因素，并且二者在血管新生中具有協(xié)同作用[1-5]，是腫瘤治療的重要靶分子，在腫瘤的生物治療中起了舉足輕重的地位。本室的抗腫瘤復(fù)合肽基因工程疫苗以細(xì)菌硫氧還原蛋白為載體蛋白，計(jì)算機(jī)模擬得到一系列VEGF和bFGF 相關(guān)表位連接到載體蛋白的C端構(gòu)成的融合蛋白。bFGF和VEGF優(yōu)勢抗原表位組成的復(fù)合肽疫苗內(nèi)共同激發(fā)抗bFGF抗體和抗VEGF抗體，2種抗體協(xié)同作用，共同阻斷其信號通路，以達(dá)到阻斷腫瘤生長的作用。

疫苗是一種特殊的生物制品，有效性和安全性是構(gòu)成其使用價(jià)值的兩個(gè)方面，缺一不可[6]。各國都把預(yù)防用生物制品臨床前安全性評價(jià)納入法規(guī)管理的范疇。疫苗的臨床前安全性研究是指為評價(jià)疫苗安全性，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的各種臨床前動(dòng)物安全性評價(jià)[7]。臨床前動(dòng)物安全性評價(jià)的主要目的系通過相關(guān)動(dòng)物來考察疫苗的安全性，包括對免疫器官和其它毒性靶器官的影響、毒性的可逆性，以及與臨床相關(guān)的參數(shù)，預(yù)測其在大規(guī)模人群中使用時(shí)可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，降低臨床試驗(yàn)受試者和臨床使用者承擔(dān)的風(fēng)險(xiǎn)，并為臨床試驗(yàn)方案的制訂提供依據(jù)。臨床前動(dòng)物安全性評價(jià)的主要內(nèi)容包括：長期毒性實(shí)驗(yàn)、急性毒性實(shí)驗(yàn)、局部刺激實(shí)驗(yàn)、過敏實(shí)驗(yàn)和生殖毒性實(shí)驗(yàn)，而針對不同疫苗又要具體問題具體分析。本研究是在前期已完成了VBP3復(fù)合肽有效性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證了疫苗具有免疫原性，可在體內(nèi)引起抗原抗體反應(yīng)，可以中和VEGF和bFGF的促血管生成作用，并且可以顯著抑制腫瘤的生長，擬通過觀察局部刺激反應(yīng)及動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn)來評價(jià)復(fù)合肽VBP3的安全性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 新西蘭兔3只，重2.0-2.5 kg；豚鼠,雄性白色，體重250-400 g，28只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥物與試劑 基因工程復(fù)合肽VBP3，本室自行發(fā)酵表達(dá)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Sigma；0.9%生理鹽水由暨南大學(xué)華僑附屬醫(yī)院提供。

1.3儀器 Eppendoff 冷凍離心機(jī)；輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)，Letia RM 2245；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)，Taiva TB-718E型；恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)，Taiva TK-218EⅡ型，購自Pari Boy；Olympus顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

2方法

2.1家兔局部肌肉刺激實(shí)驗(yàn)[8]

① 給藥劑量及方法 實(shí)驗(yàn)前24 h，用剪毛剪剔除3只新西蘭兔兩肋側(cè)兔毛，去毛范圍左右各3 cm×3 cm。采用同體左右側(cè)對比法，皮下單次注射，注射部位為兩肋側(cè)脫毛區(qū)皮下。左側(cè)注射采用生理鹽水溶解的復(fù)合肽VBP3 ，劑量為1 g/L ；右側(cè)注射同體積生理鹽水。

② 動(dòng)物觀察 在給藥后72 h 對動(dòng)物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察(觀測指標(biāo)見表1)，觀察結(jié)束后，由耳緣靜脈注入空氣處死，分離出皮膚及皮下組織，進(jìn)行肉眼觀察。并留取標(biāo)本，制作石蠟切片。光學(xué)顯微鏡下觀察有無出血、水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變。

2.2豚鼠全身過敏實(shí)驗(yàn)

① 動(dòng)物分組 陰性對照組：給予0.2 mL 無菌生理鹽水致敏。陽性對照組：給予5 mg/0.2 mL 牛血清白蛋白致敏。低劑量組：給予0.5 mg/0.2 mL VBP3(無菌生理鹽水溶解)致敏。高劑量組：給予1 mg/0.2 mL VBP3(無菌生理鹽水溶解)致敏。

② 給藥方式 隔天皮下注射給予設(shè)定的致敏劑量，連續(xù)5次，末次致敏注射后10日，經(jīng)心臟直接注射致敏劑量的2 倍量藥液進(jìn)行激發(fā)。剩余4只豚鼠，牛血清白蛋白陽性對照組和復(fù)合肽VBP3 高劑量組各2 只，不經(jīng)過致敏直接心臟激發(fā)。

③ 動(dòng)物觀察 致敏期間，每天觀察每只動(dòng)物的癥狀；心臟注射后，按以下癥狀評分詳細(xì)觀察每只動(dòng)物的反應(yīng)、癥狀的出現(xiàn)及消失時(shí)間：0:正常；1:不安寧；2:立毛；3:發(fā)抖；4:搔鼻；5:噴嚏；6:咳嗽；7:呼吸急促；8:排尿；9:排糞；10:流淚；11:呼吸困難；12:羅音；13:紫癜；14:步態(tài)不穩(wěn)；15:跳躍；16:喘息；17:痙攣；18:橫轉(zhuǎn)；19:潮式呼吸；20:死亡。并按下列標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)其致敏性：過敏反應(yīng)陰性(-)：無過敏癥狀；過敏反應(yīng)弱陽性(+)：出現(xiàn)1-4 癥狀；應(yīng)陽性(++)：出現(xiàn)1-10 癥狀；過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性(+++)：出現(xiàn)1-19 癥狀；過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性(++++)：豚鼠死亡。在第1次、最后1次致敏和激發(fā)當(dāng)天測定每組每只豚鼠的體重。

④ 肺組織病理切片檢查 豚鼠股動(dòng)脈放血處死。取肺下葉浸泡于10% 甲醛中，2 d 后取出肺組織，石蠟包埋，切5 μm 厚度片，HE染色，顯微鏡高倍鏡下觀察肺組織是否有發(fā)生病變或炎癥細(xì)胞浸潤。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1注射部位刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.1肉眼觀察結(jié)果 家兔單次注射復(fù)合肽VBP3后，觀察72 h，3只家兔均活動(dòng)正常，處死家兔后，取出給藥部位皮膚及皮下組織，3 例肉眼觀察，皮膚部位均無明顯充血、出血、紅腫、硬結(jié)等反應(yīng)，有一例皮下組織可見0.2 cm 的局部充血,見圖1。按表1[10]，反應(yīng)級數(shù)為1級。

表1 皮下注射局部刺激性實(shí)驗(yàn)肉眼觀察指標(biāo)

Figure 1. Macroscopic observation index of the local muscular stimulation.A,B,C,G,H,I:VBP3 injection;D,E,F,J,K,L:normal saline injection.

圖1皮下注射局部刺激性實(shí)驗(yàn)肉眼觀察指標(biāo)

1.2病理切片檢查結(jié)果 注射部位皮膚及皮下組織病理切片檢查結(jié)果：注射生理鹽水組，肌細(xì)胞正常，無變性壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤；注射復(fù)合肽VBP3 組，可見散在少量肌細(xì)胞變性，肌束間可見微量炎癥細(xì)胞浸潤，以單核細(xì)胞為主，見圖2。

2豚鼠全身過敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1致敏期間豚鼠日?；顒?dòng)的變化 各組相比較：活躍程度、進(jìn)食量、排泄物形狀、分泌物、外觀未見明顯差別。飼養(yǎng)過程中，在第1次、最后1次致敏和激發(fā)當(dāng)天測定每組每只豚鼠的體重。對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，見圖3。

2.2全身過敏情況 各組均于末次致敏后10 d 1次激發(fā)，過敏反應(yīng)癥狀觀察結(jié)果見表2。生理鹽水陰性對照組：激發(fā)后無反應(yīng)，連續(xù)觀察3 h，未見過敏反應(yīng)癥狀，全身過敏評估反應(yīng)陰性。注射牛血清白蛋白陽性對照組：激發(fā)后均在30 min 內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)豎毛、呼吸急促、排尿、牌匾、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、痙攣等癥狀，有2例分別于第14 min ， 17 min 內(nèi)出現(xiàn)潮式呼吸，橫轉(zhuǎn)、隨即死亡。余均于激發(fā)后2-3 h內(nèi)緩解至恢復(fù)。全身過敏反應(yīng)評估為強(qiáng)陽性。低劑量組：連續(xù)觀察3 h，均未見過敏反應(yīng)。全身過敏反應(yīng)評估陰性。高劑量組：僅有1例于激發(fā)后18 min 出現(xiàn)立毛，全身過敏反應(yīng)弱陽性，余豚鼠均無明顯全身過敏反應(yīng)癥狀。不經(jīng)過致敏直接心臟激發(fā)的牛血清白蛋白陽性對照組和高劑量組：激發(fā)后無反應(yīng)，連續(xù)觀察3 h，未見過敏反應(yīng)癥狀，全身過敏評估反應(yīng)陰性。

Figure 2. Micropathology of the rabbits local muscle after injection(HE staining).A,B,C:VBP3 injection(×100);D,E,F:normal saline injection(×100).

圖2家兔注射局部肌肉病理切片圖

圖3不同時(shí)期豚鼠體重折線圖

表2 豚鼠激發(fā)后過敏反應(yīng)癥狀評分

BSA：bovine serum albumin；NS：normal saline.

2.3病理切片檢測結(jié)果 牛血清白蛋白陽性對照組豚鼠經(jīng)牛血清白蛋白5 次致敏后，與其它組比較，支氣管周圍有少量的嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也有增加；高劑量組發(fā)生立毛的豚鼠，肺部有病灶區(qū)，診斷為慢性支氣管炎；其它劑量組炎癥細(xì)胞較少，見圖3。

Figure 4. Micropathology of the lungs of guinea pigs after being activated(HE staining).A:positive control of BSA (×200); B: BSA without the sensitization(×200); C:negative control(×100); D: high dose vaccine without the sensitization (×100); E: high-dose vaccine (×100); F: low-dose vaccine (×100).

圖4豚鼠肺部組織病理切片圖

討 論

VBP3 復(fù)合肽是將bFGF 和VEGF 的多個(gè)抗原表位通過柔性Linker 串聯(lián)，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得。通過小鼠黑色素瘤移植瘤模型表明，該復(fù)合肽能抑制腫瘤生長及腫瘤血管新生[11]。然而，在用于人體之前，還有許多亟需解決的問題。其中，肽疫苗接種的安全性是必須首先考慮的一個(gè)方面。

刺激性是指非口服藥物制劑給藥后對給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥改變，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性實(shí)驗(yàn)是考察動(dòng)物的血管、肌肉、皮膚、黏膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選取與人類皮膚接近的新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)對象，采取與臨床一致的皮下注射方式免疫新西蘭兔，注射部位無紅腫、糜爛、潰瘍等不良反應(yīng)。切取局部組織后觀察，反應(yīng)級數(shù)為1，結(jié)果為局部刺激輕微，病理切片檢查未見皮下組織有明顯壞死及結(jié)構(gòu)破壞，只有極少量單核細(xì)胞浸潤，說明復(fù)合肽VBP3 局部皮下注射并未對實(shí)驗(yàn)對象造成不可逆性的組織損傷，可用于皮下注射。

疫苗的免疫毒性是臨床前研究關(guān)注的重點(diǎn)，由于疫苗在臨床上很可能引起超敏反應(yīng)，因此應(yīng)在臨床前完成常規(guī)豚鼠主動(dòng)過敏試驗(yàn)。主動(dòng)過敏實(shí)驗(yàn)通常是采用誘導(dǎo)-激發(fā)的方法。本試驗(yàn)誘導(dǎo)階段采用皮下注射的方法，使外來抗原進(jìn)入機(jī)體后引起T 細(xì)胞發(fā)生致敏，而激發(fā)階段是致敏淋巴細(xì)胞再次接觸相同抗原后的效應(yīng)階段。過敏反應(yīng)與劑量是沒有關(guān)系的，但是FDA要求設(shè)置多劑量組來完成試驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，參考小鼠免疫劑量100 μg，設(shè)置復(fù)合肽0.5 mg、1 mg 兩個(gè)致敏劑量組，分5 次給藥，均高于常規(guī)給藥劑量，符合實(shí)驗(yàn)要求。生理鹽水對照組無過敏反應(yīng)，而己知具有強(qiáng)致敏性的牛血清白蛋白誘發(fā)了極強(qiáng)陽性過敏反應(yīng)，而用強(qiáng)致敏性的牛血清白蛋白激發(fā)未經(jīng)過致敏的豚鼠，豚鼠并未發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，表明成功建立了豚鼠過敏模型。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物的體重均有所增加，統(tǒng)計(jì)表明各組之間的體重變化無顯著差異。VBP3 低劑量組及高劑量組，大部分均無過敏反應(yīng)，個(gè)別因個(gè)體差異可出現(xiàn)弱陽性過敏反應(yīng)癥狀，但短時(shí)間內(nèi)即可自行緩解，說明VBP3幾乎無致敏性。VBP3 以2倍劑量直接激發(fā)未經(jīng)過致敏的豚鼠均未出現(xiàn)不良或過敏癥狀，說明未經(jīng)過致敏的豚鼠一次可以承受遠(yuǎn)高于臨床劑量的VBP3 ，故認(rèn)為，一次高劑量吸收并不影響豚鼠的健康，VBP3 致敏的危險(xiǎn)性小。

雖然科學(xué)的臨床前安全性評價(jià)能夠?yàn)橐呙绲呐R床實(shí)驗(yàn)和使用提供大量的信息，但由于動(dòng)物的感染和免疫應(yīng)答過程不可能與人體完全相同，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在反映臨床安全性時(shí)必然存在局限性。但從藥物評價(jià)的角度出發(fā)，臨床前安全性評價(jià)中動(dòng)物出現(xiàn)的任何毒性反應(yīng)在臨床實(shí)驗(yàn)中都必須得到充分的重視。

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SecurityassessmentofcomplexpeptidevaccineVBP3foranti-tumorangiogenesisanalysisoflocalirritationandsystemicanaphylaxis

KANG Yan-li, WANG Hong, XIANG Jun-jian, WANG Pan-pan, Lü Wei-dong, DENG Ning

(AntibodyEngineeringCenter,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tdengn@jnu.edu.cn)

AIM: To evaluate the security of an anti-tumor angiogenesis complex peptide vaccine VBP3.METHODSThree rabbits were tested for local irritation by local subcutaneous injection of the vaccine with a self comparison method on the left/right sides of the same body. The test of systemic anaphylaxis was performed in 28 guinea pigs, in which the animals were divided into 4 groups: normal saline (NS) group, bovine serum albumin (BSA) group, low-dose vaccine group and high-dose vaccine group. The other 4 guinea pigs, 2

BSA and 2 received vaccine at a high dose, were activated directly without sensitization.RESULTSNo irritable and allergic reaction was observed in the test of all rabbits with local subcutaneous injection and most of the guinea pigs with systemic anaphylactic test. Only one guinea pig with slightly allergic response was found and spontaneously recovered soon.CONCLUSIONThe complex peptide vaccine VBP3 for anti-tumor angiogenesis is safe under the experimental conditions.

Vascular endothelial growth factors; Fibroblast growth factor 2; Complex peptide vaccine VBP3

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.022

1000-4718(2011)01-0113-06

2010-08-04

2010-11-22

廣州市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(No.2006Z2-E4051)；廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)開發(fā)基金資助項(xiàng)目(No.51206001)

△通訊作者 Tel：020-85227003； E-mail: tdengn@jnu.edu.cn