病原芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選與活性鑒定

蔡亞君，桂　震，李　鋒，楊小俊

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病原芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選與活性鑒定

蔡亞君，桂震，李鋒，楊小俊

（武漢紡織大學(xué) 環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073)

通過(guò)特異引物PCR方法和水解圈活性法對(duì)62株蘇云金芽胞桿菌菌株、26株蠟狀芽胞桿菌菌株及18株球形芽胞桿菌菌株進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選。所測(cè)蘇云金芽胞桿菌中除4株野生型菌株外均為陽(yáng)性結(jié)果，蠟狀芽胞桿菌僅1株為陰性結(jié)果，球形芽胞桿菌全為陰性結(jié)果，且水解圈法觀察結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)DNS比色法對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的幾丁質(zhì)酶比活力也進(jìn)行了測(cè)定。對(duì)這些具有致病性的病原芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶的研究對(duì)于研究其致病機(jī)理及對(duì)其進(jìn)行遺傳改良具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

幾丁質(zhì)酶；蘇云金芽胞桿菌；蠟狀芽胞桿菌；球形芽胞桿菌；比活力；致病

幾丁質(zhì)（chitin）為聚β-1，4-乙酰葡萄糖胺，是一種廣泛存在于自然界的直鏈狀高分子生物多聚體。自然界每年生成的幾丁質(zhì)數(shù)以百億噸計(jì)，是儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的天然聚合物。幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的主要成分，也大量存在于昆蟲(chóng)或節(jié)肢動(dòng)物的甲殼及昆蟲(chóng)的中腸中。幾丁質(zhì)酶（chitinase）可催化水解幾丁質(zhì)的β-1,4糖苷鍵生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG），廣泛存在于微生物、植物、昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物中，在環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。至今，芽胞桿菌屬中已有環(huán)狀芽胞桿菌（），蠟狀芽胞桿菌（，簡(jiǎn)稱(chēng)），蘇云金芽胞桿菌（，簡(jiǎn)稱(chēng)）等相繼發(fā)現(xiàn)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株。

是目前世界上應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲(chóng)劑，在多種害蟲(chóng)的綜合防治中發(fā)揮了重要的作用。與以及炭疽芽胞桿菌（.，簡(jiǎn)稱(chēng)）關(guān)系緊密，它們具有相似的形態(tài)特征和較高DNA 同源性[1]。事實(shí)上，同、、蕈狀芽胞桿菌（.，簡(jiǎn)稱(chēng)）、假真菌樣芽胞桿菌（.）以及韋氏芽胞桿菌（.，簡(jiǎn)稱(chēng)） 已經(jīng)被歸類(lèi)于芽胞桿菌屬蠟狀芽胞桿菌群[2,3 ]。

考慮到與菌株間的同源性關(guān)系，我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的87 株蠟狀芽胞桿菌群菌株，包括62 株、26 株菌株進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶活性的檢測(cè)及其活力的測(cè)定，另外也對(duì)在蚊蟲(chóng)防治中廣泛應(yīng)用的球形芽胞桿菌（，簡(jiǎn)稱(chēng)）的18株菌株同時(shí)進(jìn)行了研究。對(duì)致病性病原芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶的研究對(duì)于研究其致病性及其遺傳改良具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1菌株

所有菌株為武漢病毒研究所蟲(chóng)媒病毒媒介控制實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1.0 %NaCl，1.0 %蛋白胨，0.5 %酵母粉，pH值為7.0；LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入2 %瓊脂。

幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：10 %膠體幾丁質(zhì)（濕重），0.1 % (NH4)2SO4，0.3 % KH2PO4，0.1% MgSO4·7H2O，0.7% K2HPO4，0.05%檸檬酸鈉，0.02%酵母粉，pH值為7.0；幾丁質(zhì)誘導(dǎo)平板：在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2. 0 %瓊脂粉。

膠體幾丁質(zhì)的制備：將10 g幾丁質(zhì)粉末投入180 mL濃鹽酸中，攪拌2 h溶解后再加入1 L預(yù)冷的95%乙醇，攪拌30 min后-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取10 mL液體先離心，沉淀用50 mL 0.1 M 磷酸鈉鹽緩沖液（pH7.0）洗滌三次后溶于9 mL 0.1 M 磷酸鈉鹽緩沖液（pH6.0）中，最后得到濃度約為100 mg/mL的膠體幾丁質(zhì)。

1.3幾丁質(zhì)酶基因檢測(cè)

根據(jù)Genbank中芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因全序列的高度保守序列，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件DNASTAR設(shè)計(jì)、上海申工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成了一對(duì)幾丁質(zhì)酶基因部分序列擴(kuò)增引物CHI1：5’-TTGGGTACTTTCCTTCGTGG-3’，CHI2：5’-CGTATTTGCTGCTGGGTCAT-3’。PCR反應(yīng)體系為：模板（將新鮮活化的菌液離心收集候懸浮于適量ddH2O中，沸水浴10 min后迅速置于冰上冷卻10 min，離心取上清作為PCR模板）5 μL，10×Taq reaction buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTPs 0.5 μL，Taq polymerase 1 U，10 pM引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 sec，50℃退火3 min，72℃延伸3 min，循環(huán)28次后72℃延伸7 min。

1.4幾丁質(zhì)水解活性檢測(cè)

菌株的幾丁質(zhì)水解活性通過(guò)水解圈法進(jìn)行檢測(cè)，即在幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)平板上打直徑為0.5 cm的孔，取50 μL在30 ℃、200 r/min條件下LB 液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)的各芽胞桿菌培養(yǎng)物加入孔中，30 ℃溫箱中先正置培養(yǎng)12 h 后再倒置培養(yǎng)72 h，0.1%剛果紅水溶液染色后觀察水解圈的有無(wú)及大小。

1.5DNS比色法測(cè)定產(chǎn)酶菌的酶活力

將菌種在30 ℃、200 r/min條件下LB 液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后的200 μL培養(yǎng)物加入至5 mL幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)72 h ，培養(yǎng)物12,000 r/min離心20 min，收集上清，參照劉銘等[4]通過(guò)DNS比色法測(cè)定酶活力大小，一個(gè)酶活力單位（U） 定義為合適溫度下每小時(shí)產(chǎn)生1 μg 還原糖的酶量。

2　結(jié)果與分析

2.1芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因PCR檢測(cè)

以CHI1/CHI2作為引物，通過(guò)PCR方法檢測(cè)本室芽胞桿菌中幾丁質(zhì)酶基因的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有18株球形芽胞桿菌菌株（分別為菌株 IAB59，IAB763，IAB769，IAB872，IAB881，SD7001，LP1-G，CoK31，NRS1693，DaK64，2314-2，2317-2，LFB-Fricon 2711，CIP5125，NRS1184，ATCC-14577，2173，KellenQ）的幾丁質(zhì)酶基因檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，完全觀察不到PCR擴(kuò)增帶（電泳圖片未顯示）；在26株蠟狀芽胞桿菌野生菌株中，僅有一株（B294）的PCR結(jié)果呈陰性，有2株（B505，B601）可見(jiàn)微弱的帶，而其余23株均能觀察到明顯的擴(kuò)增帶（見(jiàn)表1）；在檢測(cè)的蘇云金芽胞桿菌31株標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株和31株分離菌株中，除4株野生型菌株（PF31、PF33、PF35和PF38）檢測(cè)結(jié)果為陰性，H34血清型菌株擴(kuò)增帶較弱外，其余菌株檢測(cè)結(jié)果均為明顯的陽(yáng)性反應(yīng)（見(jiàn)表1）。

圖1　Bacillus thuringiensis 菌株幾丁質(zhì)酶活時(shí)相分析

2.2芽胞桿菌幾丁質(zhì)水解活性檢測(cè)及活力測(cè)定

幾丁質(zhì)水解活性圈檢測(cè)表明，在18株球形芽胞桿菌菌株中，完全觀察不到幾丁質(zhì)水解現(xiàn)象；26株蠟狀芽胞桿菌野生菌株中，僅有一株（B294）完全不產(chǎn)生幾丁質(zhì)水解活性，有6株（B182、B231、B234、B310、B449、B505）產(chǎn)生微弱的幾丁質(zhì)水解活性，而其余19株均能觀察到明顯的幾丁質(zhì)水解活性，其中有5株（B089、B126、B281、B424、B538）具有很高的與陽(yáng)性對(duì)照菌株沙雷氏菌S3相當(dāng)?shù)膸锥≠|(zhì)水解活性；在蘇云金芽胞桿菌中，除四株野生型菌株（PF31、PF33、PF35和PF38）外，其余27株野生型菌株和所有31株標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株均能產(chǎn)生明顯的水解圈，其中，野生菌株Gr-9和H4標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株T04A001的水解圈直徑最大（見(jiàn)表1）。

表1　致病芽胞桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性分析總表

+: 陽(yáng)性結(jié)果；－: 陰性結(jié)果。幾丁質(zhì)水解活性: R (水解圈半徑) －r (孔半徑)；0: 無(wú)水解圈， 1: R-r≤1mm， 2: 1＜R-r≤2mm， 3: 2＜R-r≤3mm，4: 3＜R-r≤4mm，5: R-r＞4mm。

DNS比色法對(duì)蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌菌株進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶比活力的測(cè)定（見(jiàn)表1）。在蠟狀芽胞桿菌中，B182、B290、B089和B582的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量最高，分別為429、397、386、330 U/mL，與S3的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量（406 U/mL）相當(dāng)。在蘇云金芽胞桿菌中，H4血清型菌株T04A001的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量較高（355 U/mL），本研究中作為PCR檢測(cè)和水解圈活性檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照的IPS78菌株的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量略低，為191 U/mL。

2.3產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株產(chǎn)酶特性分析

選取了菌株中的H4血清型菌株T04A001和野生型的HD392、Gr-9菌株繪制了其在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)的產(chǎn)酶曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1），同時(shí)時(shí)相鏡檢觀察各階段培養(yǎng)物的芽胞生長(zhǎng)變化，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶酶活在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期、芽胞初始形成期（12 h）達(dá)到最高，分別可達(dá)到496、413、393U/ml，此后芽胞形成并逐漸脫落，酶活也隨之開(kāi)始逐漸下降。

3　討論

在本研究中，檢測(cè)的大部分蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌均含有幾丁質(zhì)酶基因和不同程度的產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，證明蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌普遍都能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。所用的PCR和水解圈的檢測(cè)方法結(jié)果一致，表明這兩種方法都具有很好的可靠性。水解圈的大小和我們根據(jù)DNS方法測(cè)定的幾丁質(zhì)酶比活力結(jié)果并不完全一致，推測(cè)與測(cè)定幾丁質(zhì)酶比活力時(shí)的取樣時(shí)間有關(guān)，如圖1中所測(cè)三株菌株的最高酶活均在12 h處，而到72 h時(shí)酶活已經(jīng)降到了很低程度。而本研究中所用PCR方法中的所用引物參照的主要是蠟狀芽胞桿菌群菌株的幾丁質(zhì)酶基因，且?guī)锥≠|(zhì)水解活性的檢測(cè)方法也不一定適合球形芽胞桿菌，因此在球形芽胞桿菌未檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶活性，并不能說(shuō)明所有球形芽胞桿菌都不能產(chǎn)幾丁質(zhì)酶。

大量研究證明，外源幾丁質(zhì)酶的加入對(duì)微生物殺蟲(chóng)劑具有增效作用[5]；在蘇云金芽胞桿菌中表達(dá)幾丁質(zhì)酶，使幾丁質(zhì)酶與殺蟲(chóng)晶體蛋白共表達(dá)，能提高對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的毒力[6-8]。在幾丁質(zhì)酶對(duì)雙翅目害蟲(chóng)的研究方面，已證明幾丁質(zhì)酶對(duì)埃及伊蚊具有微弱毒力[9]，且通過(guò)在球形芽胞桿菌中表達(dá)幾丁質(zhì)酶，已顯著提高了球形芽胞桿菌對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)抗性品系的抗性[10]，不僅對(duì)球形芽孢桿菌在蚊蟲(chóng)防治中逐漸引起的抗性問(wèn)題有了解決辦法，對(duì)于蘇云金芽胞桿菌在害蟲(chóng)防治實(shí)際應(yīng)用中逐漸嚴(yán)重的抗性問(wèn)題也提供了解決思路。因此，本研究對(duì)病原芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶菌株的篩選和活性測(cè)定對(duì)于病原芽胞桿菌在生物防治中的更好應(yīng)用也具有重要意義。

[1] Helgason E, Caugant D A, Olsen I, et al. Genetic structure of population of Bacillus cereus and B. thuringiensis isolates associated with periodontitis and other human infections[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38 (4) : 1615-1622.

[2] Lechner S, Mayr R, Francis K P, et al. Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group[J]. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48(4): 1373- 1382.

[3] Nakamura L K. Bacillus pseudomycoides sp. nov[J]. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48(3): 1031- 1035.

[4] Liu M, Cai Q X, Liu H Z, et al.Chitinolytic activities in Bacillus thuringiensis and their synergistic effects on larvicidal activity[J]. J Appl Microbiol, 2002, 93: 374-379.

[5] Sampson M N, Gooday G W. Involvement of chitinases of Bacillus thuringiensis during pathogenesis in insects[J]. Microbiology, 1998, 144: 2189-2194.

[6] Lertcanawanichakul M, Wiwat C, Bhumiratana A, et al. Expression of chitinase-encoding genes in Bacillus thuringiensis and toxicity of engineered B. thuringiensis subsp. aizawai toward Lymantria dispar larvae[J]. Curr Microbiol, 2004, 48: 175-181.

[7] Tantimavanich S, Pantuwatana S, Bhumiratana A, et al. Cloning of chitinase gene into Bacillus thuringiensis subsp. aizawai for enhanced insecticidal activity[J]. J Gen Appl Microbiol, 1997, 43: 341-347.

[8] Thamthiankul S, Moar W J, Miller M E, et al.Improving the insecticidal activity of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai against Spodoptera exigua by chromosomal expression of a chitinase gene[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 65: 183-192.

[9] Thamthiankul S, Suan-Ngay S, Tantimavanich S, et al. Chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. Pakistani[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56: 395-401.

[10]Cai Y J, Yan J P, Hu X M, et al. Improving the insecticidal activity against resistant Culex quinquefasciatus mosquitoes by expression of chitinase gene chiAC in Bacillus sphaericus[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73: 7744-7746.

Chitinolytic ActivityDetection in Pathogenic Bacillus sp. Strains

CAI Ya-jun, GUI Zhen, LI Feng, YANG Xiao-jun

(College of Environmental Science and Engineering, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430073, China)

The presence of chitinase gene and the chitinolytic activity among pathogenic Bacillus sp. strains have been detected by PCR method and chitinase activity assays. The results showed that no chitinase gene and chitinase production been observed in 1 of 26 Bacillus cereus strains, 4 of 62 B. thuringiensis strains and all 21 B. sphaericus strains. All other strains could produce chitinolytic activity during their growth. The investigation of chitinase-producing strains in pathogenic Bacillus sp. provide us more information for the research of Bacillus sp. strains’ pathogenesis and chitinase’ application potency in insect control.

Chitinase; Bacillus thurinngiensis; B.cereus; B.sphaericus chitinolytic activity; pathogenic

Q89

A

1009－5160(2011)03－0058－04

蔡亞君（1980-），女，博士，講師，研究方向：應(yīng)用微生物遺傳改良.

武漢紡織大學(xué)?；痦?xiàng)目（2008Z24）.