煙酸對(duì)滑子菇液體菌種菌絲體得率及胞外多糖的影響

田艷春，王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

煙酸對(duì)滑子菇液體菌種菌絲體得率及胞外多糖的影響

田艷春，王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

以不同濃度的煙酸作為刺激因子，對(duì)滑子菇液體培養(yǎng)后的菌絲體及胞外多糖得率進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)證明在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸均可刺激滑子菇菌絲體的生長(zhǎng)及其他生物量的得率，當(dāng)加入煙酸濃度為0.8ppm時(shí)，胞外多糖的得率、菌絲體的得率都為最佳，這就為滑子菇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了較好的理論依據(jù).

滑子菇；煙酸；菌絲體得率；胞外多糖得率

滑子菇隸屬于真菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、傘菌目、絲膜菌科、鱗傘屬.原產(chǎn)日本，因它的表面附有一層粘液，食用時(shí)滑潤(rùn)可口而得名.滑子菇不僅味道鮮美，富含有益于人體健康的蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類、礦物元素、維生素等營(yíng)養(yǎng)保健物質(zhì)，而且附著在滑菇菌傘表面的粘性物質(zhì)是一種核酸，對(duì)保持人體的精力和腦力大有益處，并且還有抑制腫瘤的作用.據(jù)有關(guān)專家試驗(yàn)，其提取物對(duì)小白鼠s～180和艾氏腹水癌抑制率均為70％.

煙酸也稱作維生素B3，或維生素PP，屬于維生素B族.煙酸是人體必需的13種維生素之一，是一種水溶性維生素，屬于維生素B族.煙酸在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過(guò)程和糖類無(wú)氧分解的過(guò)程；另外煙酸還可以促進(jìn)胰島素的反應(yīng)，使人遠(yuǎn)離糖尿病.缺乏煙酸主要有以下幾種表現(xiàn)：前驅(qū)癥狀，體重減輕，疲勞乏力，記憶力差、失眠等，如不及時(shí)治療會(huì)出現(xiàn)皮炎、腹瀉和疾呆現(xiàn)象；皮膚癥狀，典型癥狀常風(fēng)在肢體暴路部位，如手背、腕、前臂、面部、頸部、足背、踝部出現(xiàn)對(duì)稱性皮炎；消化系統(tǒng)癥狀，初期很少出現(xiàn)，至皮膚和消化系統(tǒng)癥狀明顯時(shí)出現(xiàn)，經(jīng)癥患者可有全身乏力、煩躁、抑郁、健忘及失眠等.重癥則有狂躁、幻聽(tīng)、神志不清、木僵、甚至癡呆.

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度煙酸對(duì)滑子菇液體菌種菌絲體干重、胞外多糖得率的影響，以期為生產(chǎn)合理添加有關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分，保證高產(chǎn)穩(wěn)定提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)流程

滑子菇母種擴(kuò)大培養(yǎng)——→液體培養(yǎng)——→生長(zhǎng)因子實(shí)驗(yàn)——→菌絲體得率和胞外多糖測(cè)定

2 材料與方法

2.1 滑子菇母種的擴(kuò)大培養(yǎng)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)菌種：

江蘇省天達(dá)食用菌研究所提供

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、水1000mL.

2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.2.1 培養(yǎng)基的制作

將馬鈴薯去皮，挖掉芽眼，稱200g切成薄片，加入1000mL蒸餾水.在電爐上煮沸15min，并不斷攪拌，直至馬鈴薯煮至酥而不爛的程度，用4至6層紗布過(guò)濾，將濾液繼續(xù)加熱，同時(shí)加入瓊脂20g,葡萄糖20g，煮沸，使藥品全部溶解.

制備好后的PDA培養(yǎng)基趁熱用漏斗分裝于18mm×18mm或20mm×20mm的干燥試管中,裝入量為試管高度的1/5,切勿使培養(yǎng)基黏附于試管口壁,如有黏附則用干凈的紗布擦去.分裝好后要使試管豎直放置，不能傾斜.塞上棉塞，棉塞在管內(nèi)外長(zhǎng)度約2：1，其作用是保證透氣性，防止雜菌感染.

2.1.2.2 培養(yǎng)基滅菌

在分裝好的試管棉塞外部包一層牛皮紙或兩層報(bào)紙，以免滅菌時(shí)水蒸氣浸濕棉塞.將捆扎好的試管培養(yǎng)基放入全自動(dòng)立體式高壓蒸汽滅菌鍋，1.47×105Pa壓力下滅菌30min.然后在滅菌完畢自然冷卻至60℃左右時(shí)制備成斜面，斜面長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的3/4為宜，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，隨機(jī)抽取2-3支放入30±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，如培養(yǎng)基表面光滑無(wú)雜菌污染，可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)或備用.

2018年發(fā)展對(duì)象住建局辦公室副主任王芳每次驛站活動(dòng)結(jié)束后，都會(huì)寫(xiě)下心靈感悟。她在紀(jì)事本上寫(xiě)道：“我要珍惜難得機(jī)會(huì)，在驛站不斷錘煉自己、讓自己慢慢成長(zhǎng)?！?/p>

2.1.2.3 滑子菇母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大培養(yǎng)

轉(zhuǎn)管擴(kuò)大培養(yǎng)工作在紫外燈殺菌環(huán)境的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行.接種前，將斜面培養(yǎng)基，接種工具，滑子菇母種，酒精燈，75％酒精棉等放入超凈工作臺(tái)，封閉進(jìn)行紫外燈照射消毒30min，然后關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)吹風(fēng)，進(jìn)行擴(kuò)繁.

首先將洗干凈的雙手伸入超凈工作臺(tái)中，用酒精棉球擦拭雙手和菌種試管外壁，點(diǎn)燃酒精燈，灼燒接種鏟.然后，左手拿斜面試管和菌種管，用右手小拇指和手掌夾住試管的棉塞拔出，將灼燒的接種鏟在火焰上方慢慢伸入母種試管中，待溫度不能灼傷菌種時(shí)，鏟出綠豆大小的菌種塊接入斜面試管的中央，保持菌絲朝上并輕壓一下，移出接種鏟（接種鏟在伸入和移出試管過(guò)程中不能碰觸試管壁），灼燒試管口和棉塞，塞好棉塞.即完成一支試管的接種，重復(fù)上述操作，接完后放入24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中生長(zhǎng).菌絲生長(zhǎng)7—8d左右基本滿管，挑選生長(zhǎng)健壯、潔白、濃密且均勻的二級(jí)母種用于液體菌種的生產(chǎn).

2.2 滑子菇液體菌種的培養(yǎng)

2.2.1 液體菌種培養(yǎng)試驗(yàn)流程圖

初級(jí)液體培養(yǎng)基的制備——→菌種塊的接入及靜置培養(yǎng)——→搖床培養(yǎng)——→次級(jí)液體培養(yǎng)基的制備——→生長(zhǎng)因子的添加——→菌種液的轉(zhuǎn)接——→搖床培養(yǎng)——→菌絲體干重的測(cè)定和胞外多糖的測(cè)定

2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：玉米粉5％，蔗糖1％，硫酸鎂0.3％，磷酸二氫鉀0.15％，維生素B1微量.

2.2.3 實(shí)驗(yàn)菌種

母種以PDA培養(yǎng)基為承載的滑子菇二級(jí)母種.

2.2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.4.1 初級(jí)液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

首先按配方在70℃恒溫水浴鍋里乳化玉米粉，過(guò)濾后取其上清液分裝到250ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶100ml，然后每瓶加入硫酸鎂0.3g、磷酸二氫鉀0.15g、維生素B15mg、蔗糖1g、玻璃珠10粒、最后用8層紗布封口，用報(bào)紙包好后與接種鏟、鑷子、小托盤(pán)一起放入滅菌鍋內(nèi)滅菌30min.

將滅好菌的培養(yǎng)基連同擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種一同放入超凈工作臺(tái)中紫外燈滅菌30min.打開(kāi)吹風(fēng)無(wú)菌操作，向每一錐形瓶中接入一塊1cm2大小的斜面菌種，接完后置于恒溫箱中24±1℃靜置培養(yǎng)36h，待菌絲延伸至液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入恒溫?fù)u床培養(yǎng)，條件為24±1℃，150r/min，搖床培養(yǎng)可以使菌絲體的菌齡一致，菌絲體保持正常的呼吸，均勻的生長(zhǎng).培養(yǎng)6—7d，當(dāng)多數(shù)瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生絨毛狀分枝的菌絲球，培養(yǎng)液澄清并呈金黃色，散發(fā)淡淡菇香時(shí)，關(guān)閉搖床.

2.2.4.2 生長(zhǎng)因子實(shí)驗(yàn)

次級(jí)液體培養(yǎng)基的配方：馬鈴薯20％，蔗糖1％，磷酸二氫鉀0.15％，硫酸鎂0.3％.

次級(jí)液體培養(yǎng)基的制備：制備20％馬鈴薯汁（方法同PDA培養(yǎng)基的制備）2800mL，然后加入蔗糖28g，磷酸二氫鉀8.4g，硫酸鎂4.2g，分裝在28個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶均加入120mL.

表1 生長(zhǎng)因子的添加

依次編號(hào)，分別加入7個(gè)不同濃度的煙酸作為刺激因子（每個(gè)濃度做4瓶，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性），1號(hào)作為對(duì)照不加煙酸.向每一錐形瓶加入10顆玻璃珠，用八層紗布封口，外部再包扎一層牛皮紙或兩層報(bào)紙放入自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋1.47×105Pa壓力下滅菌30min.滅菌后，壓強(qiáng)降到0，溫度降到30℃左右取出，打開(kāi)吹風(fēng)無(wú)菌操作，向每個(gè)錐形瓶中接入生長(zhǎng)良好的液體菌種的培養(yǎng)液10mL（含菌絲球，并盡量使其菌絲球大小和分布較為均勻），以此來(lái)保證每個(gè)濃度的煙酸所刺激的菌絲處于相同的起點(diǎn)，接完后置于恒溫箱中24±1℃靜置培養(yǎng)36h，轉(zhuǎn)入恒溫?fù)u床培養(yǎng)，條件為24±1℃，150r/min，培養(yǎng)7d，當(dāng)多數(shù)瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生絨毛狀分枝的菌絲球，培養(yǎng)液澄清并呈棕黃色，散發(fā)淡淡菇香時(shí)，關(guān)閉搖床.

考察指標(biāo)：菌絲生長(zhǎng)量（干重），胞外多糖含量.

考察因素：不同濃度的煙酸.

考察方法：?jiǎn)我蜃訉?shí)驗(yàn)法

2.3 測(cè)定方法

2.3.1 菌絲干重的測(cè)定

將搖床培養(yǎng)的接入不同濃度的煙酸的菌絲體在超凈工作臺(tái)中過(guò)濾.濾液放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，菌絲體放入60℃烘干箱內(nèi)烘干至恒重，以菌絲體干重（mg/mL）計(jì)算菌絲體得率，如表2所示.

表2 不同煙酸濃度下菌絲體得率

圖1 不同煙酸濃度下菌絲體得率

2.3.2 胞外多糖的測(cè)定（苯酚-硫酸法）

2.3.2.1 苯酚-硫酸法測(cè)胞外多糖的原理

苯酚-硫酸試劑可與游離的寡糖或多糖中的己糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應(yīng)，呈橙黃色，且顏色穩(wěn)定，在波長(zhǎng)490nm處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖濃度呈線性關(guān)系，從而可以利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定樣品的多糖含量.

2.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取干燥葡萄糖0.1g，用去離子水準(zhǔn)確定容至100mL，得到1mg/mL葡萄糖溶液，搖勻后備用.準(zhǔn)確稱取苯酚9g，去離子水準(zhǔn)確定容至60mL，即得到15％的苯酚溶液，棕色瓶中避光備用.取10支試管，第一支為空白對(duì)照試管，其余編號(hào)2-10，按表3方法操作：

按表3方法加入藥品后震蕩，搖勻，于25℃恒溫水浴箱中保溫20min，然后以1號(hào)作為空白對(duì)照，在490波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo)（ug/mL）,吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2.

表3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所加藥品列表

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為490nm處測(cè)定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，由圖可知，其吸光度與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，方程表達(dá)式為y=0.0071x-0.132，將樣品通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)出光吸收值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖求出樣品中糖濃度.

2.3.2.3 樣品多糖含量的測(cè)定

將過(guò)濾后保存的濾液從冰箱中取出，分別取各溶液0.05mL稀釋500倍，吸取2mL稀釋后的樣品按上述步驟操作，測(cè)出其在490nm波長(zhǎng)下的吸光值，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的多糖含量（mg/mL），制作表格4并繪制成圖3.

表4 不同煙酸濃度下滑子菇胞外多糖得率

圖3 不同煙酸濃度下滑子菇胞外多糖得率

3 結(jié)果分析

3.1 培養(yǎng)基滅菌效果的檢測(cè)

滅菌后的斜面培養(yǎng)基取任意3—5支放入30±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，無(wú)任何生命生長(zhǎng)跡象，可以確定所設(shè)置的滅菌條件達(dá)到無(wú)菌操作要求，培養(yǎng)基無(wú)雜菌污染.可用于下一步試驗(yàn).

3.2 母種擴(kuò)大繁殖菌絲體生長(zhǎng)現(xiàn)象

接入PDA斜面培養(yǎng)基的滑子菇菌塊48小時(shí)開(kāi)始定植，7天左右菌絲滿管，其日平均生長(zhǎng)速度為1.42cm/d，菌絲潔白、濃密、粗壯、氣生菌絲少、有菇香、為優(yōu)良菌種，適合用于液體培養(yǎng).

4 小結(jié)與討論

4.1 在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸時(shí)對(duì)滑子菇菌絲體生長(zhǎng)均有不同程度的影響.

由圖1可知：當(dāng)煙酸濃度在0-0.8ppm時(shí)，滑子菇菌絲體得率與其成正相關(guān)；當(dāng)煙酸濃度為0.8ppm菌絲體率得率達(dá)到最高峰；當(dāng)煙酸濃度為0.8-1.2ppm時(shí)，菌絲體得率與其成負(fù)相關(guān).由此證明0.8ppm時(shí)是促進(jìn)滑子菇菌絲體生長(zhǎng)的最適煙酸濃度.

4.2 在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸時(shí)對(duì)滑子菇胞外多糖均有不同程度的影響.

由圖3可知：煙酸濃度在0-0.8ppm時(shí)，滑子菇胞外多糖得率與其成正相關(guān)；煙酸濃度為0.8ppm時(shí)，胞外多糖得率達(dá)到最高峰；煙酸濃度在0.8-1.0ppm時(shí)，胞外多糖得率隨煙酸濃度的增大而成負(fù)相關(guān)，但仍然促進(jìn)胞外多糖的積累；煙酸濃度為1.2ppm時(shí)，抑制胞外多糖的積累.由此證明0.8ppm時(shí)是促進(jìn)滑子菇胞外多糖積累的最適煙酸濃度.

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可得出，在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸可刺激滑子菇菌絲體的生長(zhǎng)及其他生物量得率，當(dāng)加入煙酸濃度為0.8ppm時(shí)，胞外多糖得率、菌絲體的得率都為最佳，這就為滑子菇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了較好的參考價(jià)值.

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1673-260X（2011）12-0180-03