可再生使用的磁性納米修飾C反應蛋白電流型免疫傳感器*

侯建國，曹玉廷，周漢坤，孟令花，胡富陶，干 寧

(寧波大學材料科學與化學工程學院，浙江寧波 315211)

臨床上C反應蛋白(CRP)檢測對冠心病的早期診斷有較高價值［1－2］。目前檢測血清中CRP主要基于免疫學原理，分析方法主要有:熒光、放射、化學發(fā)光、酶聯(lián)等免疫分析法［3］等。由于上述方法普遍操作繁瑣、儀器龐大、需專業(yè)人員操作［4］，不適合于冠心病潛在人群的現(xiàn)場篩查。而開發(fā)一些簡便、價廉、精確且易于推廣的CRP現(xiàn)場快速檢測方法是解決大規(guī)模樣品篩查，并實現(xiàn)冠心病早期診斷的關鍵之一，意義重大。電化學免疫傳感器具有快速、高靈敏、便攜等優(yōu)點，在臨床類樣品檢測中應用越來越廣泛［5］，尤其是安培型酶聯(lián)免疫傳感器，可通過酶催化放大免疫反應產(chǎn)生的電流信號，進一步提高傳感器靈敏度［6］。目前報道的安培型酶聯(lián)免疫傳感器缺乏簡易、高效、穩(wěn)定的抗體和酶固定方法，導致其易失活;而電極無法更新，修飾麻煩，無法滿足現(xiàn)場快速檢測需要［7－8］。解決上述問題關鍵在于尋求新型的抗體標記材料，以提高抗體標記率;同時簡化探針在電極表面修飾過程［9－10］;選擇可批量生產(chǎn)，低成本的免疫電極制備方法。

近年來，在納米Fe3O4表面包裹上膠體Au構建的Fe3O4(核)/Au(殼)(GMPs)金磁微粒，由于具有良好的生物相容性，超順磁性和導電性［11］，受到越來越多的關注，被應用于生物分子標記及免疫磁珠構建［12］。崔亞麗等用種子聚合法合成了粒徑約為50 nm的GMPs并用其標記抗體［13］，由于 GMPs表面大量存在的Au-NPs，可以顯著提高抗體標記密度、穩(wěn)定性和生物活性。在外磁場作用下，該類探針即易于實現(xiàn)對待測物的分離富集，又可方便吸附固定在電極表面，由此可構建電極表面更新的安培免疫傳感器。CNTs由于其良好的導電性，強大的吸附性能和優(yōu)良的生物相容性［14］，已經(jīng)被廣泛用于電極表面修飾材料。含有兩個氨基的硫堇(Thi)染料分子是一種良好的電子媒介體，由于HRP可以催化Thi和 H2O2之間的氧化還原反應［15］。因此，將HRP標記抗體和Thi共同修飾到電極上，Thi可作為電極與抗體標記HRP酶間的電子傳遞媒介體，可發(fā)展基于Thi-H2O2-HRP的無媒介體安培免疫傳感器［16］。但是Thi等電子媒介體由于分子量小，水溶性好，將其固定到電極表面時很容易擴散到溶液中，導致傳感器穩(wěn)定性差［17］。CNTs可以與Thi通過π－π堆積作用［18］結合形成穩(wěn)定的CNTs-Thi復合物，當其固定到電極后，可有效防止Thi在電極表面泄露。此外，CNTs還可以提高Thi的電子傳輸效率。SPCE是采用絲網(wǎng)印刷工藝，在絕緣基片(如PVC塑料，耐火陶瓷)上沉積一層或數(shù)層印刷油墨制備而成，具有制作簡便、成本低、樣品消耗量小、可批量化生產(chǎn)等諸多優(yōu)點［19－20］。

綜上所述，我們基于Thi-H2O2-HRP體系，采用GMPs標記辣根過氧化物酶標的抗體(HRP-anti-CRP)制備磁性探針，進而組裝在MCNTs-Thi-Nafion修飾的SPCE作為基底電極上，制備了一個無媒介、磁性可控、可再生的安培免疫傳感器。Nafion用作膜材料將MCNTs-Thi固定在電極表面，不僅可以阻止MCNTs-Thi在電極表面的流失［21］，而且與傳統(tǒng)的安培型酶聯(lián)免疫傳感器相比，其SPCE基底電極可以重復利用，抗體探針可控固定，修飾過程簡單，保證了檢測穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。而由于該類探針具有高的抗體和酶標記密度，對抗原捕獲能力強，將其用于血清中痕量CRP檢測，獲得了良好的結果。

1 實驗部分

1.1 化學試劑

硫堇、牛血清白蛋白(美國Sigma有限公司)，Nafion(分子量:2000，wt%=5.0%，中國河森有限公司)，2－氨基乙硫醇(日本TCI有限公司)，甲苯，戊二醛溶液(25%)和H2O2(30%)(上海國藥集團化學試劑有限公司)，多壁碳納米管(MCNTs，直徑小于5 nm，深圳納米技術港有限公司)，0.1 mol/L磷酸緩沖溶液為支持電解質(zhì)(PBS，用 KH2PO4、Na2HPO4和NaCl配制，pH 6.5)，C反應蛋白定量檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，包含一系列不同濃度的CRP標準溶液及辣根過氧化物酶標記的CRP抗體(北京科躍中楷生物技術有限公司)，實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次去離子水(Millipore公司，美國)。

1.2 儀器和測量

循環(huán)伏安法(CV)，示差脈沖伏安法(DPV)和電化學阻抗譜(EIS)均在CHI－660B(中國上海辰華公司)上進行。絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)(西班牙eDAQ技術公司)，其中:工作電極與對電極均為印刷碳電極，參比電極為印刷Ag/AgCl電極，S－3400N型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)，H－7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)，S2 RANGER X射線熒光光譜儀(德國Bruker公司)。

1.3 MCNTs-Thi和MCNTs-Thi-Nafion復合物的制備

MCNTs按照文獻報道［22］直接在 0.5 mol/L 鹽酸中超聲4 h，然后用蒸餾水洗滌直到洗液呈中性，離心，50℃真空干燥24 h。MCNTs(1 mg)和 Thi(2 mg)溶解在1 mL pH 6.5的 PBS中超聲12 h，以形成MCNTs-Thi復合物，未和MCNTs結合的Thi可離心去除，獲得純凈的MCNTs-Thi復合物。最后，取1 mg MCNTs-Thi溶解在含有100 μL 5%Nafion和900 μL 0.1 mol/L pH 6.5 的 PBS 溶液中，在室溫下超聲30 min制備MCNTs-Thi-Nafion溶液。

1.4 HRP-anti-CRP和BSA在GMPs表面的組裝過程

參照文獻［23］的制備方法，將1.5 mL GMPs(0.5 mg/mL)與0.5 mL 5 mmol/L 2－氨基乙硫醇混合、機械攪拌24 h，沉淀物用磁鐵轉(zhuǎn)移分離并用二次蒸餾水洗滌，棄上清液，再向上述黑色沉淀中加入2 mL戊二醛的甲苯溶液在室溫下輕輕攪拌反應6 h，磁鐵分離，沖洗，并將上述沉淀物與濃度為1.0 mg/mL的HRP-anti-CRP溶液混合，在4℃恒溫搖床反應12 h，得到 HRP-anti-CRP/GMPs生物納米粒子。接著，HRP-anti-CRP/GMPs在濃度為 3%的BSA中37℃溫育反應1 h，以封閉GMPs剩余的活性位點，防止其對CRP抗原產(chǎn)生非特異性吸附。將制備的HRP-anti-CRP/GMPs納米探針分散在20 mL pH 6.5 PBS 中，4 ℃儲存，備用。

1.5 免疫傳感器的制備

將SPCE表面依次用無水乙醇和蒸餾水沖洗幾次，晾干備用，取 5 μL上述制備的 MCNTs-Thi-Nafion溶液滴在SPCE工作電極表面，紅外燈下晾干，作為基底電極。再取5 μL濃度為0.83 mg/mL的磁性納米探針懸浮液滴在電極表面，在SPCE工作電極平面背部加一塊磁場強度為0.3T的圓柱形磁鐵(其圓面和SPCE背面緊貼，如圖1(b))借助磁力將HRP-anti-CRP/GMPs吸附于電極表面，室溫下自然晾干即通過簡單的兩步法制得了免疫傳感器(圖1)。每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去HRP-anti-CRP/GMPs納米材料以更新電極。此傳感器在4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 方案1圖示

1.6 電化學測量

該免疫分析是基于免疫結合物的生成阻礙標記酶HRP與Thi之間的電子傳遞而進行測定。首先，測定SPCE/MCNTs-Thi-Nafion/HRP-anti-CRP/GMPs免疫電極在含4 mmol/L H2O2的pH 6.5的PBS中的峰電流(I0);然后，依次取15 μL不同濃度的CRP標準溶液滴在上述免疫電極表面于30℃溫育15 min。再測定該免疫傳感器在含有相同濃度H2O2的上述PBS溶液中的峰電流(I)。CRP含量的檢測是由檢測傳感器表面免疫反應發(fā)生后其對過氧化氫的電流響應下降值來進行的。該免疫電極在溫育CRP前后的電流響應下降值ΔI=I0－I。采用免疫傳感器溫育后電流下降百分率CR%=100×(I0－I)/I0，對溶液中的CRP進行定量，可消除不同電極之間由于表面積不同造成的電流強度差異影響。

2 結果與討論

2.1 不同納米粒子復合物和免疫傳感器的表征

圖2 電子顯微鏡表征圖

2.1.1 透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)分析。圖2(a)～圖2(c)分別為 MCNTs，MCNTs-Thi和MCNTs-Thi-Nafion/GMPs的TEM表征圖。與單純的 MCNTs(圖2(a))相比，形成的MCNTs-Thi結合物(圖2(b))明顯直徑變寬，這表明MCNTs的表面已成功結合了 Thi［24］。圖 2(c)為MCNTs-Thi膜上吸附GMPs后的TEM圖，可清楚地觀察到均勻分散的GMPs顆粒。MCNTs-Thi-Nafion/GMPs的SEM圖(圖2(d))出現(xiàn)了明顯的MCNTs管網(wǎng)狀結構，且出現(xiàn)了大量分散性良好的GMPs，這表明借助于外磁鐵的作用，GMPs已成功固定于MCNTs-Thi-Nafion復合物膜上。

2.1.2 X射線熒光光譜分析。采用X射線熒光光譜表征HRP-anti-CRP/GMPs復合物。在HRP-anti-CRP/GMPs納米探針的譜圖上出現(xiàn)了Fe(kα－6.45 keV)，Au(LA－9.7 keV)和 S(kα－2.32 keV)的特征峰。

2.1.3 不同修飾層電極的電化學交流阻抗。電化學交流阻抗是研究電極表面修飾狀況的一種有效方法。圖3分別為不同階段的修飾電極在5 mmol/L Fe(CN)64－/3－(簡稱 FeCN，內(nèi)含 0.5 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗圖譜，高頻區(qū)的半圓直徑表示電子傳遞阻抗(Ret)，低頻區(qū)的線性部分表示擴散過程。圖2現(xiàn)實了該免疫電極在制備不同階段的阻抗譜，可以很明顯看出，裸SPCE電極的阻抗譜幾乎是一條直線(圖3曲線a)，這是典型的擴散控制過程。當電極表面修飾MCNTs-Thi-Nafion以后，通過阻抗譜看出其具有400 Ω的較小電阻(圖3曲線b)。通過靜電吸附將GMPs組裝到SPCE/MCNTs-Thi-Nafion電極表面，結果顯示電阻減少至100 Ω(圖3曲線c)，這是因為:GMPs具有良好的導電性，可有效提高FeCN電子傳遞速率。隨著該電極進一步固定抗體HRP-anti-CRP，進而溫育溶液中CRP抗原，結果顯示阻抗不斷增加(圖3曲線d和曲線e)，這表明:在電極表面的抗體和免疫復合物大大增加了對FeCN 電子傳遞的阻抗［27］。

圖3 免疫電極制備過程中，在0.1 M PBS(pH 6.5)+0.1 M KCl+5.0 mM Fe(CN)64－/3－的交流阻抗圖

2.2 不同修飾電極的電化學行為

圖4顯示了免疫傳感器制備過程中不同電極在0.1 mol/L pH 6.5的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖。由圖4曲線a可以看出在0～－0.8 V的掃描范圍內(nèi)，裸電極沒有出現(xiàn)氧化還原峰，而在電極表面修飾一層MCNTs(圖4曲線b)后殘留電流變大，這是因為MCNTs增大了電極比表面積，是電極導電性增強。與SPCE/MCNTs修飾電極相比，SPCE/MCNTs-Thi-Nafion修飾電極在－0.3 V左右有一對穩(wěn)定的準可逆氧化還原峰曲線(圖4曲線c)，該氧化還原峰為Thi的特征峰［26］，這表示 MCNTs-Thi牢固結合并固定在電極上。在 SPCE/MCNTs-Thi-Nafion上吸附GMPs后(圖4曲線d)，峰電流明顯增加，這是因為GMPs外圍包裹的納米金有促使電子傳輸?shù)淖饔?。GMPs結合HRP-anti-CRP與BSA之后峰電流下降，是因為電極之間的內(nèi)阻加大，該結果和交流阻抗結論一致(圖4曲線e)。

圖4 不同修飾電極在pH 6.5 PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安響應圖

2.3 免疫傳感器對H2O2的響應

圖5 免疫傳感器加入H2O2前后的循環(huán)伏安圖

圖5的曲線a與 b分別為免疫傳感器加入H2O2前后的循環(huán)伏安圖。從圖5的曲線a可見，在無H2O2時，電極表面有一對準可逆的Thi氧化還原峰。當加入4 mmol/L H2O2后，修飾電極的氧化峰電流降低而還原峰電流明顯增加，還原峰電位同時向負方向微小移動(圖5的曲線b)，表現(xiàn)出明顯的酶催化反應過程。該還原電流的增加是由于HRP催化H2O2氧化Thi的反應而使電極表面Thi的氧化態(tài)增加所造成的。傳感器在20 ng/mL CRP溶液中溫育后，還原催化電流下降(圖5的曲線c)，這是由于電極表面形成的免疫復合物掩蔽了HRP的活性中心，導致HRP催化氧化Thi的能力下降，峰電流減小。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1 MCNTs-Thi復合物和 GMPs在電極表面固定量 滴加 15 μL 含 0.25 ～2.0 mg/mL MCNTs-Thi的Nafion于SCPE表面，探索其在電極表面的最佳濃度。電流響應隨著MCNTs-Thi濃度從0.25 mg/mL增加到1.0 mg/mL而逐漸增加，當濃度高于1.0 mg/mL時，峰電流又逐漸減小，這可能是因為隨著MCNTs-Thi濃度超過了Nafion飽和吸附量后，會在電極表面產(chǎn)生流失，所以選擇最終濃度為1.0 mg/mL的MCNTs-Thi滴加在電極表面?？疾炝穗姌O表面GMPs的濃度從0.5 mg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)對電流的影響，結果發(fā)現(xiàn)，峰電流先隨GMPs濃度的增加而增加，在0.83 mg/mL時達到最高點，由于GMPs高于此濃度后會有團聚現(xiàn)象，由此導致電流下降。因此，選擇0.8 mg/mL GMPs作為修飾最佳濃度。

2.4.2 不同pH、溫育溫度、溫育時間對免疫反應的影響 免疫反應受pH、溫育溫度、溫育時間等影響，強酸或強堿性環(huán)境會破壞蛋白質(zhì)微觀結構，降低蛋白質(zhì)的活性。此外，Thi的氧化還原過程需要一個質(zhì)子。因此，pH值會影響Thi的電化學性能?？疾烀庖唠姌O在pH 5.0～pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中對4 mmol/L H2O2的響應(圖6(a))。實驗發(fā)現(xiàn)，免疫電極在pH 6.5時響應電流最大，故本實驗選擇pH 6.5的PBS。圖6(b)顯示了免疫傳感器在0.5 mmol/L ～5.0 mmol/L H2O2濃度范圍內(nèi)催化電流大小，由圖可知，催化電流隨H2O2濃度的增加而增大，當達到4 mmol/L時，電流響應趨于不變，此時可能溶液中的H2O2達到了飽和，因此實驗中選擇加入4 mmol/L H2O2。圖6(c)顯示了溫育溫度對免疫傳感器安培響應的影響。當溫育溫度從10℃到40℃升高時，免疫傳感器的電流響應下降值ΔI也隨之增加，并在35℃達到最大值。而當溫育溫度高于40℃時，可導致抗體蛋白變性，因此選擇35℃作為實驗中溫育溫度。圖6(d)顯示了溫育時間與免疫傳感器的電流響應下降值ΔI的關系。由圖可示，隨著溫育時間的增加，免疫傳感器的電流響應下降值ΔI隨之增加并趨于一穩(wěn)定值，說明此時抗原－抗體反應已達平衡，在不影響實驗結果的情況下，選擇15 min為優(yōu)化的溫育時間。

圖6 (a)緩沖液pH值；(b)底液中H2O2濃度；(c)傳感器在10 ng/mL CRP中溫育后溫育溫度；(d)傳感器在20 ng/mL CRP中溫育后溫育時間對免疫傳感器的影響

2.5 免疫傳感器對CRP的DPV響應

在優(yōu)化的測定條件下，利用SPCE/MCNTs-Thi-Nafion/HRP-anti-CRP/GMPs免疫電極在不同濃度的CRP樣品中溫育，用DPV方法測定，并獲得了CRP測定校正曲線。圖7(a)所示，隨著溫育液中CRP含量的增加，免疫傳感器的安培響應降低。在高濃度的CRP范圍內(nèi)，電流下降百分比(CR%)無明顯改變，這可能是電極表面CRP的濃度已接近飽和。圖7(b)為CR%與CRP的標準曲線，在0.1 ng/mL～80 ng/mL兩段濃度范圍內(nèi)成線性關系。回歸方程分別為CR%=6.34C(CRP)+1.02和CR%=0.833C(CRP)+4.27線性相關系數(shù)分別為0.9983和0.9925。該方法獲得的檢測下限為0.04 ng/mL(3σ)。

圖7 (a)SPCE/MCNTs-Thi-Nafion/HRP-anti-CRP/GMPs免疫電極對不同濃度CRP的DPV電流響應圖(從 a 到 i的［CRP］=0，0.1，0.5，3.5，5.0，10，50，80，110 ng/mL)；(b)CRP 濃度與信號變化值(CR%)之間的標準曲線

2.6 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

采用4個同一批次制備的CRP傳感器，對10 ng/mL的CRP標準溶液進行測定，獲得組間相對標準偏差 RSD為3.3%(n=4)。同一批次印制的SPCEs結構穩(wěn)定(包括電極材料、面積和碳層厚度等相同)，而固定的磁性探針量和分布均一，使得該免疫傳感器具有較好的制備重復性。免疫電極在4℃冰箱中存放30 d，傳感器在含1 mmol/L H2O2的pH 6.5 PBS溶液中測定其安培響應僅下降為原來的94%。這表明該傳感器具有較好的儲存穩(wěn)定性，同時也表明修飾電極可以有效地阻止電子媒介體Thi的流失，且電極表面GMPs/HRP-anti-CRP的生物活性保持良好。

2.7 樣品及干擾測定

研究了血清中主要可能干擾物對免疫電極檢測CRP的影響。結果表明:當傳感器在濃度為20 ZG CRP及分別含有AFP(400 ng/mL)、人免疫球蛋白(HIgG，1μg/mL)、CA19－9(20 ng/mL)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，20 ng/mL)，以及 2 μg/mL 的 BSA、尿酸、抗壞血酸、多巴胺、L－半胱氨酸等的溶液中溫育，傳感器對H2O2的電催化信號在有與沒有干擾物的溶液中僅有4.8%的差別，表明該傳感器選擇性良好。

2.8 免疫傳感器的再生

在本工作中，磁性納米探針可通過外部磁鐵固定并在測定后從SPCE上洗脫，從而使SPCE/MCNTs-Thi-Nafion基底電極可更新使用。本文采用同一根Nafion膜修飾電極作為基底電極，在外磁場作用下，重復固定磁性探針五次，并對濃度為10 ng/mL的CRP樣品進行平行測定，測量的相對標準偏差為2.0%。表明該電極具有良好的再生性，Nafion膜基底電極可反復使用，由此可大大減少電極的使用成本，并簡化了傳感器的制備過程。

2.9 實際血清樣品測定

為了驗證此方法應用到臨床醫(yī)學的可能性，對實際血清樣品進行了檢測。選取含有3 ng/mL～35 ng/mL CRP的若干血清樣品，取1 mL溶解在5 mL PBS中，采用本法進行了測定并和標準的化學發(fā)光免疫分析方法(CLA)進行了對照，結果見表1。

表1 本方法和ELISA方法測定實際血清樣品中CRP的結果比較(n=3)

該法的相對偏差在1.8%到4.3%之間，表明該傳感器適合用于血清CRP含量的測定。

3 結論

本文基于GMPs標記酶聯(lián)抗體制備了磁性納米探針，進而將其磁性吸附固定在碳納米管修飾絲網(wǎng)印刷電極表面，構建了電極表面可更新，可再生使用的安培免疫傳感器，并成功地用于血液中CRP的檢測。該傳感器具有以下優(yōu)點:(1)避免了電解質(zhì)溶液中電子媒介體的加入，減少了背景干擾。(2)合成的磁性納米探針，具有較高的酶標抗體標記密度，使得其對CRP抗原捕獲能力大大提高;而富集的HRP酶進一步催化放大免疫反應產(chǎn)生的電流信號，使得檢測靈敏度大大增強。(3)磁性探針易于通過外磁場控制固定和移除電極表面，由此獲得的免疫電極表面可更新使用。(4)每次測定后只需更換探針即可進行下一次檢測，節(jié)約了電極使用成本，縮短了分析時間。本傳感器具有制作簡便，磁性可控、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。因此，非常適合于對人血清中低含量 CRP的檢測，具有潛在的臨床應用價值。

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