抗苗勒激素對ICSI治療中卵巢反應的預測價值

韓巍巍，Schaffrath M，Holze V，Pollow K，Seufert R，童曉文

(1.同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦保中心，上海 200065;2.德國美因茨大學醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，德國美因茨 55101)

自1978年第1例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術發(fā)展迅速，目前已有上百萬的患者成功孕育了胎兒。隨著年齡的增長，卵巢儲備(卵巢內原始卵泡的數(shù)量和質量)降低，試管嬰兒(in vitro fertilization，IVF)的成功率逐漸下降。抗苗勒激素(anti-Müllerian hormone，AMH)被認為是抑制始基卵泡的募集和早期生長卵泡發(fā)育的重要因子之一。

為了研究控制性超排卵過程中血清與卵泡液中AMH水平對治療反應性的預測價值，本研究檢測了促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone-agonist，GnRH-a)長方案以及GnRH拮抗劑聯(lián)合方案治療不同階段血清和卵泡液中AMH水平，分析其與控制性超排卵治療后各項臨床指標的相關性。探討AMH作為卵巢反應性的一種新的監(jiān)測指標的可能性及其對控制性超排卵用藥的指導作用。

1 資料與方法

1.1 控制性超排卵

參與實驗的53例患者在德國美因茨大學醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心接受ICSI治療。采用GnRH-a長方案進行控制性超排卵治療的共40例，采用GnRH拮抗劑聯(lián)合方案的共13例。53例共分為4組:沒有胚胎植入組(6例)、胚胎種植失敗組(34例)、生化妊娠組(5例)、臨床妊娠組(8例)。測定患者血清及卵泡液中 AMH、E2、孕酮(progestone，P)水平。所有患者均簽署參與治療及實驗的知情同意書，本次實驗研究獲得美因茨大學道德委員會的批準。

在GnRH-a長方案促排卵過程中，在治療前一周期黃體中期(第18～21天)給予長效GnRH-a進行降調節(jié)，當完全降調節(jié)達到時，即血清E2≤50 pg/ml，第2天開始給予重組卵泡刺激素(recombinant FSH，rFSH)。在GnRH拮抗劑聯(lián)合方案中，在月經(jīng)第2天給予rFSH，治療第7天開始應用GnRH拮抗劑。rFSH的初始劑量為150～300 IU/d(根據(jù)年齡、體質量指數(shù)、既往促排卵治療反應決定初始劑量)。通過B型超聲檢查和血E2的測定，監(jiān)測卵泡發(fā)育情況并調整rFSH的劑量。當B超監(jiān)測優(yōu)勢卵泡≥18 mm，或有兩個卵泡≥17 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)5000～10000 IU，促使卵泡成熟。34～36 h后，在靜脈麻醉狀態(tài)，B超引導下進行穿刺取卵術，并立即在顯微鏡下取出卵細胞，移到含胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取卵后4～6 h，MⅡ期的卵子(出現(xiàn)第一極體)行 ICSI，成功后置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱。取卵16～18 h后出現(xiàn)兩個原核和兩個極體，標志體外受精成功。取卵3 d后對受精卵細胞數(shù)量、核外碎片程度，以及卵裂球對稱均勻程度對受精卵進行評分，選取2～3個受精卵植回患者體內。取卵14 d后檢測血-HCG，陽性為生化妊娠。胚胎種植6周后B超檢測到宮內孕囊、胚芽和原始心管搏動，診斷為臨床妊娠。在取卵后對患者給予孕酮(600 mg/d)支持，如果確定為妊娠，繼續(xù)補充孕酮到第10周，自第10周起減少劑量為400 mg/d，繼續(xù)補充至第12周。

1.2 血清和卵泡液中激素水平測定

在GnRH-a長方案促排卵治療的40例患者中，rFSH應用第2天抽取靜脈血5 ml。在全部53例患者中，OPU當天抽取靜脈血5 ml，并收集優(yōu)勢卵泡的卵泡液。標本穩(wěn)定于室溫20 min后，3000 r/min離心10 min，離心半徑6 cm，吸出上清液裝入無菌試管置入－20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。AMH ELISA試劑盒用來檢測AMH含量。應用自動酶免疫分析儀檢測E2、P含量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 一般情況

53例患者的臨床資料，見表1。體質量指數(shù)(body mass index，BMI)、基礎 FSH、rFSH 用量、受精率在4組間無顯著性差異。臨床妊娠組的患者年齡顯著低于沒有臨床妊娠組(P=0.017)。年齡與獲卵數(shù)呈明顯負相關(總獲卵數(shù):P＜0.001，r=－0.535;MⅡ成熟卵數(shù):P ＜0.001，r= －0.470)。

表1 患者的一般資料及接受促排卵治療后的各項臨床指標Tab.1 Comparison of clinical and pretreatment parameters in undergoing ovarian stimulation

2.2 血清及卵泡液中各項激素水平比較

53例患者血清及卵泡液中各項激素檢測結果見表2。在GnRH-a長方案治療組與GnRH拮抗劑聯(lián)合方案治療組，OPU當天血清AMH水平無顯著性差異(GnRH-a長方案組:1.1 ±1.3 ng/ml，GnRH拮抗劑聯(lián)合方案組:0.7 ±0.6 ng/ml，P=0.341)，卵泡液中AMH水平在兩組間表達也無明顯差異(GnRH-a長方案組:2.1 ±2.1 ng/ml，GnRH 拮抗劑聯(lián)合方案組:1.6 ±0.8 ng/ml，P=0.378)。

2.3 AMH水平與臨床各項指標的相關性

AMH水平與各項指標相關性見表3，GnRH-a長方案促排卵治療中，治療初始血清AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負相關，與獲卵總數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關。治療初始血清AMH水平與E2水平呈正相關(P=0.027，r=0.329)，與 P 水平無明顯相關性。

表2 血清及卵泡液中各項激素水平Tab.2 Comparison of follicular fluid and serum concentrations of hormones in undergoing ovarian stinulation

表3 血清及卵泡液中AMH水平與臨床各項指標的相關性Tab.3 Correlation between hormone levels and clinical parameters by statistical analysis

53例患者OPU當天血清AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負相關，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關。OPU當天血清AMH水平與E2水平呈正相關(P=0.012，r=0.364)，與 P 水平無明顯相關性。OPU當天血清E2水平與獲卵數(shù)呈正相關(總獲卵數(shù):P＜0.001，r=0.682;成熟卵數(shù):P＜0.001，r=0.667)。

OPU當天卵泡液中AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負相關，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關。卵泡液中AMH水平與OPU當天血清AMH水平呈正相關(P ＜0.001，r=0.570)。

3 討 論

目前，全球不孕夫婦正呈逐年上升趨勢，不孕不育癥的發(fā)病率為15% ～20%。1978年，第1例體外受精的嬰兒在倫敦誕生，輔助生殖技術迅速發(fā)展，并廣泛應用于不孕癥的臨床治療方面。今天，在輔助生殖技術中廣泛應用控制性超排卵技術(controlled ovarian hyperstimulation，COH)。其理想的條件包括:用藥物對卵巢進行超常的刺激以得到適當多數(shù)目的卵子，得到高質量的卵子;用藥后體內的內分泌環(huán)境及子宮內膜條件要適合胚胎的著床、生長、發(fā)育;盡量減少副作用如卵巢過度刺激綜合征;整個過程可以被人們所調控。在治療過程中，卵巢對促性腺激素的反應是臨床成功的關鍵因素，因此在患者進行昂貴的輔助生殖治療(assisted reproductive technology，ART)前評估卵巢儲備功能，在治療過程中監(jiān)測，預測卵巢反應性，有重要的臨床意義，可以幫助臨床醫(yī)生篩選患者，制定個體化的治療方案，減少卵巢過度刺激綜合征和卵巢低反應的發(fā)生，獲得最佳的治療結果。

AMH又稱苗勒抑制物質(Müllerian inhibiting substance，MIS)，是轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)家族的成員，由兩個相同的70 kb亞基組成的二聚糖蛋白。在對動物［1］及人類［2-3］的研究中發(fā)現(xiàn)，AMH僅由性腺合成。它主要表達于胎兒的睪丸組織，起促進男性生殖道的分化作用。出生后，在女性，AMH由卵巢顆粒細胞產(chǎn)生，在新生兒期體內幾乎測不到，到性成熟后達最高水平，絕經(jīng)后又消失。在自然月經(jīng)周期中，募集的卵泡少，發(fā)現(xiàn)AMH水平在整個月經(jīng)周期中波動極小，呈相對穩(wěn)定狀態(tài)［4］。近期的研究表明AMH是可以預測卵巢儲備及控制性超排卵治療后卵巢反應的一個重要因子［5-7］。在對雌鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，AMH抑制始基卵泡的募集，阻止卵泡池的消耗［8］，同時還可抑制卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)依賴性的竇前卵泡生長［7］。Weenen證實人類卵巢中AMH的表達類似于嚙齒目動物［9］。與其他反應卵泡狀態(tài)的因子不同，AMH僅有卵巢顆粒細胞分泌。研究表明竇卵泡計數(shù)與月經(jīng)第3天血清AMH水平密切相關，超過與基礎FSH、抑制素B(inhibin B，INHB)、E2(estradiol)的相關程度。另外，在促排卵治療過程中，血清AMH水平逐漸下降，可能反映了由于超排卵而引起小竇卵泡數(shù)目的急劇減少，肯定了較大卵泡缺乏AMH的表達［10］。

卵巢儲備隨著婦女的年齡增長而下降，卵巢皮質區(qū)卵泡逐漸減少。相關研究［11］對年齡≥41歲的接受IVF/ICSI治療的431例患者進行分析，結果表明41～43歲患者每一次采卵的成功分娩率為2%～7%，≥44歲患者無1例成功分娩，≥45歲患者無1例成功妊娠。Templeton證實年齡可以預測IVF的結局［12］。本研究也發(fā)現(xiàn)，患者年齡與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈負相關，顯然年齡是影響ART治療結局的一個重要因素。

研究顯示，月經(jīng)周期第3天AMH水平可以預測促排卵治療的卵巢反應性及卵巢儲備［5-6，13］?；A AMH 水平與卵巢反應性呈正相關［6，14-15］，與獲卵數(shù)呈正相關，且相關性明顯高于基礎AMH水平與基礎FSH、抑制素B的相關性［16］?？刂菩猿怕堰^程中，AMH的動態(tài)變化與自然周期不同［17］。促排卵過程中AMH水平可以更好地預測卵巢反應性［18］。Penarrubia 等［19］證實，GnRH-a 長方案促排卵過程中，初始階段血清AMH水平在周期取消組明顯偏低，輔助生殖治療第5天的AMH水平比基礎AMH水平能更好地預測周期取消率?？刂菩猿怕阎蠥MH水平能夠反應卵細胞的質量和卵巢反應性［20］。本研究中，GnRH-a長方案控制性超排卵過程中，早卵泡期血清AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負相關，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關。小竇卵泡的AMH含量明顯高于排卵前卵泡AMH含量，表明血清AMH水平主要反應小竇卵泡的數(shù)量［21］。在COH過程中，多個卵泡發(fā)育，血清AMH水平逐漸下降，可能反應了由于促排卵導致的小竇卵泡數(shù)量的進行性下降［22］。La Marca等［23］發(fā)現(xiàn)，在女性生育后期，血清 AMH 水平下降，在絕經(jīng)期，即使用十分精密的測量方法，仍無法檢測到AMH水平。這些證據(jù)更加說明AMH可以預測卵巢儲備。與基礎AMH水平相比，COH早卵泡期的血清AMH水平，在外源性促性腺激素作用下，對卵巢反應性有更好的預測價值。

本研究中，在GnRH-a長方案與GnRH拮抗劑聯(lián)合方案促排卵治療中，OPU當天AMH水平無明顯差異，提示在GnRH-a長方案與GnRH拮抗劑聯(lián)合方案促排卵過程中，卵泡發(fā)育的微環(huán)境，AMH以及其他激素的分泌無明顯差別［24］。本研究中，OPU當天血清AMH水平與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關。Wunder等［25］也得出相同的結論。相關研究對33名GnRH-a長方案+ICSI治療患者進行研究，發(fā)現(xiàn)在黃體中期，促排卵早卵泡期，以及排卵期血清AMH水平與獲卵數(shù)呈正相關，黃體中期與早卵泡期的AMH水平能更好的預測臨床妊娠［26］。本研究發(fā)現(xiàn)OPU當天卵泡液中AMH水平與年齡、總rFSH用量呈負相關，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關，并且與當天血清AMH呈正相關。最近一項研究［25］表明，在COH治療受孕組，OPU當天卵泡液中AMH水平明顯高于未受孕組。Takahashi等［27］也證實，接受IVF治療受精成功組卵泡液中AMH水平明顯高于未成功組。

體外受精-胚胎移植技術是一項有創(chuàng)的，昂貴的治療，接受治療患者同時承受生理和心理上的壓力。制定個性化的治療方案，在治療過程中監(jiān)測卵巢反應，及時評估卵巢不良反應的發(fā)生有重要意義。目前，控制性超排卵治療過程中常規(guī)采用B超、血清E2水平監(jiān)測卵巢反應性，但仍存在較高的周期取消率和卵巢反應低下發(fā)生率。通過本研究得出的結論，在控制性超排卵治療過程早卵泡期血清AMH水平與卵巢反應性(總獲卵數(shù)和成熟卵數(shù))呈正相關，檢測治療過程早卵泡期血清AMH水平有助于更加準確的評估卵巢反應性，預測卵巢反應低下的發(fā)生，有助于調整治療方案，調整rFSH使用劑量，達到更好的治療效果。因卵泡穿刺當天血清和卵泡液AMH水平，與獲取卵子數(shù)量，成熟卵數(shù)均有顯著相關性，考慮檢測卵泡液中AMH水平操作較復雜，可以僅檢測OPU當天血清AMH水平，作為參考條件之一選擇胚胎植入數(shù)量，有助于避免多胎妊娠的發(fā)生。

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