乳品中大腸菌群快速檢測(cè)片的研究

段學(xué)輝，魏斌，傅奇，郭炳其，賈奎艷

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330047）

乳品中大腸菌群快速檢測(cè)片的研究

段學(xué)輝，魏斌，傅奇，郭炳其，賈奎艷

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330047）

建立了乳品中大腸菌群檢測(cè)片快速檢測(cè)方法，即以國(guó)標(biāo)法中的乳糖發(fā)酵管培養(yǎng)基為基本營(yíng)養(yǎng)成分，優(yōu)化添加輔助營(yíng)養(yǎng)成分、指示劑、緩沖劑、選擇性抑菌劑，通過(guò)冷水凝膠劑等均勻固化于基片上，樣品滴加檢測(cè)片上，培養(yǎng)16～18 h即可直接依據(jù)檢測(cè)片顏色的變化定量檢樣中大腸菌群的含量，結(jié)果可用MPN值報(bào)告。實(shí)驗(yàn)以多管發(fā)酵法為對(duì)照，分別用標(biāo)定菌濃的大腸桿菌菌液和市售乳品樣進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果表明，檢測(cè)片的最低檢出限為0～4 mL-1，所測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法結(jié)果相比符合率為96.7%，樣品檢測(cè)報(bào)告時(shí)間縮短50多小時(shí)，兩種方法所測(cè)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，快速檢測(cè)片作為一種價(jià)廉、簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，能應(yīng)用于乳品中大腸菌群的快速檢測(cè)。

乳品；大腸菌群；快速檢測(cè)片

0 引言

大腸菌群在食品安全中受到嚴(yán)格監(jiān)控，是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，大腸菌群的檢測(cè)日益受到食品生產(chǎn)企業(yè)和衛(wèi)生監(jiān)測(cè)部門(mén)的高度關(guān)注。乳品中大腸菌群的檢測(cè)通常采用國(guó)標(biāo)多管乳糖膽鹽發(fā)酵法，但乳品中的基質(zhì)容易對(duì)結(jié)果造成干擾[1]，且檢測(cè)耗時(shí)費(fèi)力，報(bào)告一個(gè)陽(yáng)性結(jié)果需要72 h，難以滿(mǎn)足實(shí)際生產(chǎn)和監(jiān)測(cè)中的快速檢測(cè)需要。隨著食品衛(wèi)生檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，酶分析法[2]、分子生物學(xué)法[3-5]和儀器分析法[6-8]等技術(shù)方法逐漸得到應(yīng)用，但新方法對(duì)儀器設(shè)備和操作人員有特殊要求，生產(chǎn)企業(yè)和基層衛(wèi)生監(jiān)測(cè)部門(mén)的設(shè)備和操作水平難以適用。本文報(bào)道了一種大腸菌群快速檢測(cè)片研制及其應(yīng)用效果，為生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)測(cè)部門(mén)提供了一種乳品中大腸菌群的快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

菌種為大腸桿菌；鮮奶；酸乳；奶粉（市售）。

氯化三苯四氮唑（TTC）、氯化鈉、磷酸氫二鉀等均為分析純，膽鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴甲酚紫、PEG、黃原膠、瓜爾豆膠、卡拉膠、聚丙烯酸鈉、層析硅膠等均為化學(xué)純，中速定性濾紙(規(guī)格為5cm×5 cm，11cm×11 cm)，聚乙烯樹(shù)脂薄膜

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，pH值為7.3±0.1，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌15 min。

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基[9]：蛋白胨20 g，乳糖10 g，膽鹽5 g，氯化鈉5 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%溴甲酚紫溶液2.5 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4，115℃滅菌15 min。

改良浸液配方：胰蛋白胨10 g，乳糖15 g，SDS 0.1 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的TTC溶液5 mL，磷酸氫二鉀4 g，氯化鈉3 g，質(zhì)量濃度為1.6 g/100mL溴甲酚紫溶液4 mL，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌15 min。

1.3 菌懸液制備

劃線(xiàn)甘油管中保藏的大腸桿菌于斜面培養(yǎng)基上，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液。

檢測(cè)流程如圖1所示。

1.4 吸水率的測(cè)定[10]

分別稱(chēng)取0.1g干燥凝膠劑樣品，放入300 mL燒杯中，加入100 mL去離子水，室溫下溶脹1.5 h后，以100目濾網(wǎng)過(guò)濾15 min，記下濾液量，分別計(jì)算各凝膠劑在去離子水中的吸收量，吸水率為

式中：V初始為凝膠劑吸水前加入去離子水體積；V濾出水為凝膠劑吸水后濾出溶液體積；M凝膠劑質(zhì)量為加入凝膠劑的質(zhì)量；ρ為水的密度1.0 g/mL。

1.5 凝膠劑的保水性能分析

稱(chēng)取0.1 g各凝膠劑粉末于300 mL燒杯中，加入100 g去離子水，配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的凝膠劑溶液。將直徑為7 cm的中速濾紙浸漬于各凝膠溶液中1 min，待干燥后，分別放于各平皿內(nèi)，稱(chēng)重(m1)。向各皿內(nèi)的濾紙片上分別滴加1 g去離子水，平皿上覆蓋一層保鮮膜，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔4 h測(cè)定一次(m2)。以保水百分率對(duì)時(shí)間作圖，保水率為

2 結(jié)果與討論

2.1 不同凝膠劑對(duì)吸水率和保水性性能的影響

實(shí)驗(yàn)選取常用凝膠劑瓊脂、PEG、黃原膠、瓜爾豆膠、卡拉膠、聚丙烯酸鈉、層析硅膠。通過(guò)吸水率和保水性實(shí)驗(yàn)來(lái)考察凝膠劑的性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2可以看出，聚丙烯酸鈉的吸水量達(dá)到388.00g/g，黃原膠為40.70 g/g，瓜爾豆膠為39.60 g/g，而PEG、卡拉膠、瓊脂、層析硅膠的吸水量?jī)H分別為12.25，16.30，17.05，19.85 g/g。聚丙烯酸鈉的吸水量是常用凝膠劑瓊脂的20多倍，能比瓊脂吸附更多的檢測(cè)片浸液溶質(zhì)，在檢測(cè)時(shí)又能輔助檢測(cè)片吸附檢樣。

圖2 各凝膠劑吸水量對(duì)比

由圖3可以看出，含有0.1 g不同凝膠劑的浸漬檢測(cè)片放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，放置16 h后，含聚丙烯酸鈉的保水率為52.71%，空白組為25.25%，24 h后，含聚丙烯酸鈉的保水率為23.65%，而空白組的保水率已降至0。聚丙烯酸鈉對(duì)檢測(cè)片的保水效果最好，檢測(cè)常用的凝膠劑瓊脂在短時(shí)間內(nèi)對(duì)檢測(cè)片有一定的保水作用，至16 h時(shí)為39.40%，24 h后水分基本蒸發(fā)完全。相對(duì)于空白組，PEG、黃原膠、卡拉膠、聚丙烯酸鈉、層析硅膠等使檢測(cè)片的保水率均有不同程度的提高。結(jié)合各凝膠劑對(duì)檢測(cè)片的吸水量和保水率的影響，聚丙烯酸鈉具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，替代瓊脂為本研制檢測(cè)片所用凝膠劑。

圖3 各凝膠劑對(duì)檢測(cè)片保水性能的影響

2.2 緩沖劑濃度對(duì)培養(yǎng)基pH值和檢測(cè)片顯色靈敏度的影響

緩沖劑磷酸氫二鉀具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值和緩沖檢樣pH值變化的雙重作用。實(shí)驗(yàn)選取磷酸氫二鉀作為緩沖劑，配制兩組系列質(zhì)量濃度，一組為0～1.0 g/100 mL系列質(zhì)量濃度；另一組為1.0～2.5 g/100 mL系列質(zhì)量濃度。115℃滅菌15 min，加入已滅菌的TTC，浸漬紙片，待干燥后，分別滴加1 mL含10～102mL-1大腸桿菌的模擬鮮乳樣和酸乳于檢測(cè)片上，觀察對(duì)檢樣的緩沖效果，同時(shí)測(cè)定磷酸氫二鉀各濃度下的浸漬液pH值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和圖5所示。

由圖4中看出，當(dāng)緩沖劑質(zhì)量濃度小于0.4 g/100mL時(shí)，隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的增加，檢測(cè)片檢出的菌落數(shù)有明顯增加，質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 g/100 mL時(shí)，檢出的菌落數(shù)最多，此時(shí)pH值為7.112，繼續(xù)增加緩沖劑濃度，檢測(cè)片上可觀察的黃斑菌落數(shù)略有減少。由于溴甲酚紫的變色pH值范圍為5.2～6.8，而含有質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL磷酸氫二鉀的培養(yǎng)基滅菌后pH值為6.693，仍處在溴甲酚紫的變色范圍內(nèi)，故檢測(cè)片的顯色效果欠佳。當(dāng)緩沖劑質(zhì)量濃度為0.4 g/100 mL時(shí)，pH值接近指示劑的變色pH臨界值，且檢測(cè)片顯色效果良好，此時(shí)檢測(cè)片的靈敏度相對(duì)較高，雖然添加高于此質(zhì)量濃度的緩沖劑，檢測(cè)片的顯色效果良好，但不利于產(chǎn)酸能力弱的大腸菌群的檢出，降低了檢測(cè)片的靈敏度。

圖4 不同質(zhì)量濃度磷酸氫二鉀對(duì)靈敏度的影響

乳品中的酸奶成弱酸性，檢測(cè)片在檢測(cè)酸奶樣品時(shí)，緩沖劑需要發(fā)揮對(duì)檢樣的緩沖作用。由圖5可看出，緩沖劑各質(zhì)量濃度下檢測(cè)片呈現(xiàn)的緩沖效果。在質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL和1.5 g/100 mL時(shí)，緩沖劑的緩沖作用失效，檢測(cè)片滴加酸奶檢樣立即變黃；2.0g/100 mL時(shí)檢測(cè)片局部微黃，經(jīng)幾分鐘緩沖作用后檢測(cè)片又為藍(lán)紫色。當(dāng)緩沖劑質(zhì)量濃度為2.5 g/100 mL時(shí)，緩沖效果明顯，加樣前后檢測(cè)片均呈藍(lán)紫色，且培養(yǎng)后的菌斑清晰可見(jiàn)。圖5中，（a）的pH值為7.342；（b）的pH值為7.365；（c）的pH值為7.412；（d）的pH值為7.447。

圖5 磷酸氫二鉀用量對(duì)酸奶檢樣的緩沖效果

2.3 TTC 濃度對(duì)顯色效果的影響

分別加滅菌后質(zhì)量濃度為2 g/100 mL的TTC 0.05，0.1，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40 mL于50 mL改良浸液培養(yǎng)基中，混勻后浸泡紙片，干燥后接種大腸桿菌稀釋液，37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落顯色效果，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，當(dāng)浸漬液中加入0.05 mLTTC時(shí)，大腸桿菌在檢測(cè)片上生長(zhǎng)，菌落幾乎不著色；TTC加入量為0.1 mL和0.15 mL時(shí)，檢測(cè)片上的菌落成微紅色；0.20 mL時(shí)部分菌落顯色清晰，部分微紅色；而0.25～0.40 mL時(shí)，菌落均顯紅色，易于觀察計(jì)數(shù)，但隨著TTC用量的提高，大腸桿菌的生長(zhǎng)略微受到抑制，因此TTC用量以0.25 mL為宜。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TTC的顯色效果

2.4 檢測(cè)片基質(zhì)組成優(yōu)化

檢測(cè)片基質(zhì)在加入質(zhì)量濃度為1.6 g/100mL溴甲酚紫0.2 mL的情況下，通過(guò)單因素試驗(yàn)選取胰蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、SDS、TTC、氯化鈉、聚丙烯酸鈉等7個(gè)因素，分別取3個(gè)水平，采用L18（37）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

表2 浸液配方的因素水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用直觀分析法，18次實(shí)驗(yàn)的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，浸液配方中主要成分對(duì)于大腸菌群測(cè)定的影響順序?yàn)椋篠DS＞胰蛋白胨＞磷酸氫二鉀=TTC＞聚丙烯酸鈉＞氯化鈉＞乳糖，正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化組合為A1B1C2D1E2F1G1或A1B1C2D1E2F1G2。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，抑菌劑SDS（D）對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響顯著，因此，抑菌劑用量應(yīng)該嚴(yán)格按控量添加，這對(duì)于檢測(cè)片大腸菌群正常生長(zhǎng)和有效抑制非大腸菌群的干擾非常重要。

2.5 檢測(cè)片性能與常規(guī)方法的比較

選擇精確定濃的大腸桿菌菌懸液，采用本研究檢測(cè)片與食品中總大腸菌群檢測(cè)方法中的多管發(fā)酵檢測(cè)法、平板法進(jìn)行檢測(cè)性能比較，考察它們的檢出限、重復(fù)性、報(bào)告時(shí)間、檢測(cè)步驟繁簡(jiǎn)性、檢測(cè)成本等關(guān)鍵性能指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)比較結(jié)果如表5所示。

由表5中可以看出，檢測(cè)片的檢出限、重復(fù)性、報(bào)告時(shí)間、檢測(cè)步驟繁簡(jiǎn)性、檢測(cè)成本等關(guān)鍵性能指標(biāo)優(yōu)于目前常用的多管發(fā)酵檢測(cè)法和平板檢測(cè)法。

2.6 快速檢測(cè)片的商品檢測(cè)應(yīng)用效果

實(shí)驗(yàn)在市場(chǎng)中隨機(jī)取樣鮮乳、酸乳、奶粉各20份，分別用研制的快速檢測(cè)片和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行大腸菌群含量檢測(cè)，分析結(jié)果如表6所示。

由表6可以看出，快速檢測(cè)片法與國(guó)標(biāo)法對(duì)樣品中大腸菌群的檢測(cè)報(bào)告結(jié)果總符合率為96.7%，其中檢測(cè)片法和國(guó)標(biāo)法各檢出2份陽(yáng)性樣品。對(duì)兩種方法檢出的陽(yáng)性與陰性樣品數(shù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，快速檢測(cè)片法和國(guó)標(biāo)法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

3 結(jié)束語(yǔ)

（1）凝膠劑一直作為微生物培養(yǎng)基載體被廣泛應(yīng)用。聚丙烯酸鈉對(duì)微生物無(wú)毒害作用[11]，常溫下可溶于水，具有超強(qiáng)的吸水能力和良好的保水性能。能有效地吸附檢樣，保障菌群生長(zhǎng)環(huán)境中必須的水分。檢測(cè)片浸漬液凝膠劑常溫下不易凝固，簡(jiǎn)化了浸液維持溫度條件的操作，解決了不加瓊脂的浸液不能穩(wěn)定均勻地固定于基片的缺點(diǎn)。

表5 3種方法檢驗(yàn)的關(guān)鍵指標(biāo)比較

表6 檢測(cè)片法和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)乳品中大腸菌群結(jié)果比較

（2）磷酸氫二鉀緩沖劑在配制培養(yǎng)基時(shí)具有調(diào)節(jié)pH值的作用，在接種檢樣時(shí)，具有對(duì)檢樣酸環(huán)境變化的緩沖作用。使檢測(cè)片接種酸性檢樣時(shí)指示劑依然能夠有效顯示。檢測(cè)片用于鮮乳或奶粉樣品檢測(cè)時(shí)，培養(yǎng)基加入質(zhì)量濃度為0.4 g/100 mL磷酸氫二鉀為宜；檢測(cè)酸奶時(shí)，加入質(zhì)量濃度為2.0 g/100 mL磷酸氫二鉀可達(dá)到對(duì)檢樣的緩沖和提高檢測(cè)靈敏度。

（3）TTC是一種氫受體，在大腸菌群生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶作用下，TTC將氫（H）還原成紅色不溶性的甲賛，使菌落著色成紅色。因此TTC的添加可避免乳品檢樣基質(zhì)特性對(duì)檢測(cè)的干擾。大腸菌群檢測(cè)片培養(yǎng)基中每50 mL加入質(zhì)量濃度為2 g/100 mL的TTC溶液0.25 mL，檢測(cè)菌落顯色效果較好。當(dāng)TTC用量過(guò)少時(shí)，檢測(cè)片上菌落著色淺或無(wú)，用量過(guò)多時(shí)又會(huì)對(duì)大腸菌群的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。

（4）本檢測(cè)片法結(jié)果的報(bào)告形式，適用現(xiàn)行食品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的食品微生物學(xué)大腸菌群的測(cè)定和大腸菌群的計(jì)數(shù)，能以多片檢測(cè)片代替國(guó)標(biāo)中的多管發(fā)酵，具有與國(guó)標(biāo)法相同的靈敏性，且操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，檢測(cè)時(shí)間只需16～18 h，比國(guó)標(biāo)法的72 h縮短了54 h，檢測(cè)效率得到明顯提高。

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Rapid detection of coliforms in dairy using test strip

DUAN Xue-hui，WEI Bin，F(xiàn)U Qi，GUO Bing-qi，JIA Kui-yan
(State Key Laboratory of Food Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

In this study,a rapid and simple method for detection the total coliforms in dairy,fixing optimal nutrient including basic nutrition and supplementary nutrition,indicating agent,buffering agent,specific bacteriostatic agent on the designed strip through cold gel was investigated.Based on strip color change,coliforms can be quantitatively reported as MPN,and the overall assay time only needed of 16-18 hours.The conditions of the detection such as the species of cold gel and proportion of medium,as well as the concentration of indicating agent and buffering agent were studied.This method was compared to the multiple-tube fermentation using calibration of standard strain for the analysis of samples,the rapid test strip showed low detection limit of 0-4 cfu/mL.A high agreement(96.7%)was found between rapid test strip and standard on 60 commercial dairy samples.No significant difference(p＞0.05)was found between the detection results for the methods.The test strip method was cost-effective,simple,rapid and accurate,can be used to detect coliforms in dairy.

dariy;coliform bacreria;rapid test strip

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0038-04

2010-10-12

段學(xué)輝(1958-)，男，教授，從事食品生物技術(shù)方向研究。