小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇

牛 蕾，祝長(zhǎng)青,2，周光宏,*，徐幸蓮，李 彬，江 蕓

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 200001)

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇

牛 蕾1，祝長(zhǎng)青1,2，周光宏1,*，徐幸蓮1，李 彬1，江 蕓1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 200001)

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌作為一種食源性致病菌逐漸引起了關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)利用胰蛋白胨培養(yǎng)基、改良磷酸鹽緩沖液和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養(yǎng)基對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌，并采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)增菌效果進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明：在純菌體系中胰蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增菌作用優(yōu)于其他兩種培養(yǎng)基，并且增菌24h后即可檢測(cè)到該菌。在混菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)過(guò)改良磷酸鹽緩沖液增菌后靈敏性最高，并且增菌時(shí)間可縮短至8h。因此在實(shí)際檢測(cè)中可采用改良磷酸鹽緩沖液對(duì)該菌進(jìn)行增菌檢測(cè)。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；前增菌；實(shí)時(shí)熒光PCR；培養(yǎng)基；食源性致病菌

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)是一種革蘭氏陰性短桿菌。它在畜禽中含量較高，豬帶菌率最高。本菌是一種嗜冷菌，在0～4℃仍能繼續(xù)繁殖并產(chǎn)生毒素。在冰箱內(nèi)存放的污染該細(xì)菌的食品對(duì)人仍具有感染性[1]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌成為全球廣泛關(guān)注的一種要的食源性致病菌。1985—1987年我國(guó)從20 個(gè)省市的39412例腹瀉患者中檢出患小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病例為256例，占0. 64%[2]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌所致疾病有回腸炎、腸系膜淋巴結(jié)炎、闌尾炎、結(jié)節(jié)性紅斑、關(guān)節(jié)炎、敗血癥和各種膿腫等[3]。

目前國(guó)內(nèi)外各標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)方法均為傳統(tǒng)生化鑒定方法，此方法既耗時(shí)又需要大量的勞動(dòng)力。實(shí)時(shí)熒光PCR方法由于具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程、快速、特異性強(qiáng)以及靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)而成為目前檢驗(yàn)該菌的主要方法[4-12]。但由于食品體系較復(fù)雜且雜菌率較高以致檢出率較低，所以在使用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌之前增菌是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)選取胰蛋白胨培養(yǎng)基(TSB)、改良磷酸鹽緩沖液(PSB)和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養(yǎng)基(ITC)3種培養(yǎng)基作為增菌液，分別在純菌體系和雜菌體系中對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行前增菌，利用PCR方法對(duì)增菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC21565)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。陰性肉樣為市售肉制品。

PSB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、CIN-1培養(yǎng)基、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定套裝培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；ITC培養(yǎng)基及配套添加劑 青島海博公司。

DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PCR預(yù)混液GoTaq Green Master Mix 美國(guó)Promega公司；Taqman探針預(yù)混液2×Premix Ex TaqTM大連寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler PCR儀 美國(guó)Eppendorf公司；ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；LX-100手掌型離心機(jī) 江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠；Anke TGL-16G 高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；WH-2 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；ZKSY-42智能恒溫水箱 南京科爾儀器設(shè)備有限公司；LD ZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BIO-RAD凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 前增菌培養(yǎng)

1.3.1.1 純菌體系

取4.8×104CFU/mL小腸結(jié)腸炎耶爾森菌純菌液0.1mL分別接種于100mL PSB、TSB、ITC增菌液中，并置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每隔8h取菌體沉淀一次，并取一定稀釋度的菌液0.1mL涂布于CIN-1選擇培養(yǎng)基上，置于26℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.1.2 雜菌體系

以480CFU/g肉樣為標(biāo)準(zhǔn)將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌接種于10g陰性肉樣中，并將此肉樣分別置于裝有90mL PSB、TSB、ITC增菌液的三角瓶中，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每隔8h取菌體沉淀一次，取菌液劃線接種于CIN-1選擇培養(yǎng)基上，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，另外將可疑菌落接種于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定套裝培養(yǎng)基上進(jìn)行生化鑒定。

1.3.2 DNA提取

取各時(shí)間點(diǎn)保留的菌體沉淀，參照天根生化科技有限公司細(xì)菌DNA提取試劑盒操作流程提取DNA。提取出來(lái)的DNA作為反應(yīng)模板，以備后續(xù)PCR反應(yīng)使用。

1.3.3 普通PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系：GoTaq Green Master Mix預(yù)混液12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.75μL，模板DNA 2μL，雙蒸水補(bǔ)足體積到25μL。引物序列：上游引物ail-F為5＇-ACT CGA TGA TAA CTG GGG AG-3＇(664-683)，下游引物ail-R為5＇-CCC CCA GTA ATC CAT AAA GG -3＇(814-833)。引物由大連寶生物科技有限公司合成。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸34s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳

利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察目的基因擴(kuò)增情況。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系：預(yù)混液2×Premix Ex TaqTM10μL (DNA聚合酶、反應(yīng)用Buffer、dNTP、Mg2+等)，引物ail-F和ail-R (10μmol/L)各0.4μL，探針(10μmol/L)0.2μL，50×Rox Reference Dye Ⅱ0.4μL，模板DNA 2μL，雙蒸水補(bǔ)足體積到20μL。探針為FAM-TCG TTT GCT TAT ACT CAT CAGGGA - Eclipse (692-715)，其5＇-端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)為FAM，3＇-端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為非熒光基團(tuán)Eclipse。探針由大連寶生物科技有限公司合成。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火及延伸34s，共40個(gè)循環(huán)。

結(jié)果判斷：Ct值≥40，可判斷樣品結(jié)果為陰性，可直接報(bào)告未檢出相應(yīng)致病菌；Ct 值＜40，可判斷該樣品結(jié)果為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

表1 純菌體系中對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌增菌不同時(shí)間后平板計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 The plate count of Yersinia enterocolitica after different cultivation time lg(CFU/mL)

如表1所示，在TSB培養(yǎng)基中該菌生長(zhǎng)速度較快，PSB培養(yǎng)基是3種培養(yǎng)基中增菌效果較差的一種。在雜菌體系中通過(guò)對(duì)各培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離，并進(jìn)行生化鑒定，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定結(jié)果如表2所示。在雜菌體系中檢驗(yàn)結(jié)果顯示TSB培養(yǎng)基和PSB培養(yǎng)基經(jīng)16h以上增菌 時(shí)間后均有陽(yáng)性菌株被分離出來(lái)，但TSB 培養(yǎng)基檢出率不如PSB培養(yǎng)基高，而ITC培養(yǎng)基并未分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽(yáng)性菌株。

表2 雜菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification of Yersinia enterocolitica

2.2 普通PCR反應(yīng)結(jié)果

圖1 純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplified products of pure Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

如圖1所示，根據(jù)電泳條帶亮度可知在純菌體系條件下TSB培養(yǎng)基增菌效果較好，增菌 16h即可檢出該菌。在混合菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌目的基因擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。從電泳條帶亮度可以看出PSB培養(yǎng)基在雜菌體系中增菌效果較好，且經(jīng)16h增菌后即可檢測(cè)出該菌。但是由于瓊脂糖凝膠電泳靈敏度較低，所以各培養(yǎng)基具體前增菌效果需要通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 人工污染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplified products of artificially contaminated Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果

圖3 純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.3 Real-time PCR amplification curve of pure Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR原理，可以根據(jù)擴(kuò)增曲線的Ct值判斷起始菌液濃度的高低進(jìn)而得到各培養(yǎng)基的增菌效果。

由圖3可以看出，純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌只有經(jīng)過(guò)TSB培養(yǎng)基增菌后才有擴(kuò)增曲線。

表3 純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)TSB培養(yǎng)基不同時(shí)間增菌后實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果Table 3 Real-time PCR results of pure Yersinia enterocolitica in TSB medium after different cultivation time

由表3可知，8h和16h的Ct值明顯大于其他時(shí)間點(diǎn)的Ct值，所以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在經(jīng)過(guò)TSB培養(yǎng)基增菌24h后可穩(wěn)定的被檢測(cè)出來(lái)。

圖4 人工污染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.4 Real-time PCR amplification curve of artificially contaminated Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

表4 人工污染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果Table 4 Real-time PCR results for artificially contaminated Yersinia enterocolitica after different cultivation time and media

如圖4及表4所示，在雜菌體系中PSB培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基均對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌有增菌作用。但根據(jù)Ct值可知PSB培養(yǎng)基的增菌效果較好，并僅需8h即可檢測(cè)出該菌的存在。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過(guò)普通PCR反應(yīng)后，結(jié)果顯示純菌體系中TSB培養(yǎng)基是效果較好的增菌液。TSB培養(yǎng)基增菌8h后條帶較暗，這可能是由于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌正處于延滯期，所以菌液中含菌量較低。然而PSB和ITC培養(yǎng)基增菌后并未有電泳條帶產(chǎn)生可能是由兩個(gè)原因所致：首先PSB對(duì)于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增菌效果不如TSB好，這與計(jì)數(shù)結(jié)果一致；其次由于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在PSB培養(yǎng)基中為無(wú)色透明狀，所以很難獲得菌體沉淀從而致使提取DNA濃度較低。在雜菌體系中TSB培養(yǎng)基效果不如PSB培養(yǎng)基好，這可能是由于在TSB培養(yǎng)基中大多數(shù)細(xì)菌均適合增長(zhǎng)，導(dǎo)致雜菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。PSB培養(yǎng)基則選擇性較強(qiáng)，從而更適合小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增長(zhǎng)。通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定的方法可以在雜菌系體系中分離出陽(yáng)性菌株，從而排除了PCR反應(yīng)假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果顯示，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌處于純菌體系中時(shí)在TSB培養(yǎng)基中增菌效果優(yōu)于其他兩種增菌液，并且增菌24h時(shí)即可穩(wěn)定檢測(cè)。將該菌接種于陰性肉樣，用于模擬實(shí)際樣品檢驗(yàn)時(shí)的雜菌體系環(huán)境，此時(shí) PSB培養(yǎng)基的增菌效果好于TSB和ITC培養(yǎng)基，這與等[13]的研究結(jié)果基本一致，并且他還指出TSB培養(yǎng)基與PSB培養(yǎng)基相比更容易引起假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌接種量為480CFU/g的肉樣雜菌體系中，使用PSB增菌液對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)過(guò)8h的增菌即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力檢測(cè)基因包括：質(zhì)粒上的黏附素基因(yadA)、毒力活化因子基因(virF)，染色體上的黏附侵襲位點(diǎn)基因(ail)、耐熱腸毒素基因(ystA)[14]。在這4種毒力基因中，質(zhì)粒由于在菌種培養(yǎng)過(guò)程中易丟失，而Yst基因由于在多種致病菌中均出現(xiàn)而難以保證特異性檢測(cè)該菌，所以選定特異性較高的ail基因作為檢測(cè)目的基因。本實(shí)驗(yàn)利用Nakajima等[15]設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該引物通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示特異性較好進(jìn)而極大的減少了假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。在實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中根據(jù)普通PCR中的引物選擇探針，本實(shí)驗(yàn)探針3＇端使用的淬滅基團(tuán)并非為通常采用的TAMRA基團(tuán)，而采用了非熒光基團(tuán)Eclipse。這種淬滅基團(tuán)由于本身不產(chǎn)生熒光而降低了本底信號(hào)，可使反應(yīng)的效率和可靠性增加。

隨著近年來(lái)多起食品安全事件的發(fā)生，食源性致病菌的檢測(cè)顯得尤其重要。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定方法依然是檢測(cè)致病菌的主要方法，但其具有時(shí)間長(zhǎng)、工作量大以及需要具有一定經(jīng)驗(yàn)的人員操作等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的前增菌方法的研究發(fā)現(xiàn)，利用PSB培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行8h前增菌，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

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Selection of Pre-enrichment Methods for Yersinia enterocolitica

NIU Lei1，ZHU Chang-qing1,2，ZHOU Guang-hong1,*，XU Xing-lian1， LI Bin1，JIANG Yun1
(1. Nantional Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultual University, Nanjing 210095, China；2. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 200001, China)

Yersinia enterocolitica has been paid so much attention as a kind of foodborne pathogen. The pre-enrichment of Yersinia enterocolitica was conducted by using the cultivation in TSB, PSB and ITC media. The pre-enrichment effect was evaluated by real-time PCR. The results indicated that the cultivation in TSB medium was better than other two media for pure Yersinia enterocolitica system. The enrichment time was 24 h. In addition, an enhanced sensitivity and shorten enrichment time (8 h) of Yersinia enterocolitica were achieved in the mixed microbe system containing TSB and ITC. Therefore, PSB can be used in the detection of Yersinia Enterocolitica in samples.

Yersinia enterocolitica；pre-enrichment；real-time PCR；culture medium；foodborne pathogen

TS251.1

A

1002-6630(2011)05-0168-04

2010-05-13

國(guó)際科技合作項(xiàng)目——食品質(zhì)量安全控制技術(shù)研究 (2009DFA31770)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071614)

牛蕾(1985—)，女，碩士研究生，主要從事肉品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。E-mail：hingis1985@126.com

*通信作者：周光宏(1960—)，男，教授，博士，主要從事肉品科學(xué)研究。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn