多穗柯三葉苷的抑制糖尿病關(guān)鍵酶活性和抗氧化性

張 毅，寧正祥,*，董華強(qiáng)

(1. 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641；2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，廣東 佛山 528231)

多穗柯三葉苷的抑制糖尿病關(guān)鍵酶活性和抗氧化性

張 毅1，寧正祥1,*，董華強(qiáng)2

(1. 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641；2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，廣東 佛山 528231)

從多穗柯中提取分離得到三葉苷，以抗糖尿病藥物阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)多穗柯三葉苷對(duì)小腸α-葡萄糖苷酶和胰臟α-淀粉酶活性的抑制作用和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制類(lèi)型，并以蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)其清除DPPH自由基能力。結(jié)果顯示：多穗柯三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶有明顯抑制作用，為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制效果與阿卡波糖無(wú)明顯差別，對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率低于阿卡波糖；清除DPPH自由基能力強(qiáng)于蘆丁。表明多穗柯三葉苷是一種有應(yīng)用潛力的抗糖尿病活性物質(zhì)。

三葉苷；多穗柯；α-葡萄糖苷酶；α-淀粉酶；糖尿病

Ⅱ型糖尿病又稱(chēng)非胰島素依賴(lài)型糖尿病(NIDDM)，表現(xiàn)為患者血糖水平升高[1]。近年來(lái)的流行病學(xué)研究表明，餐后血糖水平是糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)患者發(fā)展為Ⅱ型糖尿病的重要因素，嚴(yán)格控制餐后血糖可減少大血管及微血管并發(fā)癥的發(fā)生[2-5]。餐后血糖水平的上升與胰臟α-淀粉酶促進(jìn)淀粉水解和小腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶水解葡萄糖苷鍵生成葡萄糖分子密切相關(guān)[6]。因此對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制是防治Ⅱ型糖尿病的一個(gè)有效途徑。

阿卡波糖(acarbose)是臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，它也是α-淀粉酶的強(qiáng)抑制劑[7]。阿卡波糖雖然有效，但卻存在引起腸道不適等明顯的副作用[8]。研究指出這是由于對(duì)胰臟α-淀粉酶的過(guò)度抑制引起的[7]。因此，有必要尋找有效而副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制劑[9-10]。

多穗柯(Lithocarpus polystachyus Rehd) 主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)[11-12]，是我國(guó)傳統(tǒng)民間草藥和保健飲料植物[13]。Dong等[14]用多穗柯黃酮粗提物灌胃處理四氧嘧啶糖尿病模型小鼠，證明有明顯的抗糖尿病活性。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)多穗柯三葉苷抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性及抗氧化活性進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

多穗柯(Lithocarpus polystachyus Rehd)嫩葉采自貴州東部山區(qū)。

根皮苷(99.7%)、DPPH(分析純)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(PNPG)、豬胰腺α-淀粉酶(EC 3.2.1.1，VI型) 美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸、蘆丁(99.6%)、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉鉀(四水) 上海晶純?cè)噭┯邢薰?；阿卡波?德國(guó)拜耳公司。

UV-260紫外-可見(jiàn)分光光度儀 日本島津公司；2690高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；M2emicroplate reader儀 美國(guó)Molecular device公司；ZQ2000質(zhì)譜儀 美國(guó) Waters公司；DRX400核磁共振波譜儀 德國(guó)Bruker公司。

1.2 多穗柯三葉苷分離純化

提取分離步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15-16]。取多穗柯嫩葉，采用微波輔助法提取得粗提物，經(jīng)大孔樹(shù)脂和中性氧化鋁柱層析后獲得結(jié)晶。

圖1 多穗柯三葉苷提取物高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of trilobatin separated from Lithocarpus polystachyus Rehd

1.3 分析檢測(cè)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇、水體積比6:4；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm。

1.3.2 電噴霧-質(zhì)譜(ESI-MS )檢測(cè)

噴霧毛細(xì)管電壓2.89kV，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度250℃，負(fù)離子掃描，掃描范圍50～800m/z。

1.3.3 核磁共振(NMR)波譜分析

待測(cè)樣品用DMSO-d6溶解后，在室溫，400MHz條件下進(jìn)行1H和13C核磁共振波譜分析。

1.3.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[17]的測(cè)定方法，略作修改。取60μL待測(cè)液(0.8mg/mL樣品液、0.8mg/mL 阿卡波糖溶液，同量的緩沖液作為空白對(duì)照)于96孔酶標(biāo)板中，加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液 (0.2U/mL)，振勻后于37℃水浴保溫10min，加入50μL 5.0mmol/L PNPG溶液振勻，在37℃水浴中反應(yīng)20min，加入160μL Na2CO3溶液 (0.2mol/L)終止酶促反應(yīng)，置于405nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)。由于多穗柯三葉苷本身有顏色，因此每個(gè)樣品需要測(cè)定背景吸收，并最終測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。每個(gè)樣品重復(fù)3次取平均值。抑制率按式(1)計(jì)算。

式中：Aj為樣品組吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

將最大抑制率一半所需樣品的濃度定義為IC50，以評(píng)價(jià)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制水平。采用Lineweaver-Burk作圖法，對(duì)多穗柯三葉苷抑制α-葡萄糖苷酶的機(jī)理進(jìn)行分析。

1.3.5 抑制α-淀粉酶活性測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[17]的測(cè)定方法，略作修改。取40μL待測(cè)液(0.8mg/mL樣品溶液或0.8mg/mL阿卡波糖溶液，以同量緩沖液作為空白對(duì)照)于25mL比色管中，加入200μL胰α-淀粉酶溶液 (1.0U/mL)，在37℃水浴中使酶活化10min，添加400μL底物可溶性淀粉(1.0g/100mL)在25℃反應(yīng)10min，加入1.0μL DNS(A液(12.0g四水合酒石酸鉀鈉溶于 8.0mL 2mol/L NaOH)與B液(0.88g的3,5-二硝基水楊酸溶于46mL去離子水)體積比為1: 1)終止反應(yīng)，進(jìn)行沸水浴5min，冷卻至室溫后加入10mL蒸餾水以稀釋?zhuān)?40nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。抑制率按式(2)計(jì)算。

式中：Aj為樣品組吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

將最大抑制率一半所需樣品的濃度定義為IC50以評(píng)價(jià)對(duì)胰α-淀粉酶的抑制水平。

1.3.6 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[17]的方法，略作修改。以甲醇為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，吸取50μL待測(cè)液于96孔酶標(biāo)板中，加入150μL DPPH溶液 (0.2mmol/L)，搖勻，25℃避光靜置30min，置于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式(3)計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除能力。

式中：Q為DPPH自由基清除率；A0為不加試樣DPPH溶液的吸光度；At為加試樣反應(yīng)后 DPPH溶液吸光度。

以清除DPPH自由基達(dá)到穩(wěn)定態(tài)50%清除率所需加入抗氧化樣品的質(zhì)量濃度為IC50，用以表示其抗氧化能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 多穗柯黃酮結(jié)晶的結(jié)構(gòu)鑒定與表征

2.1.1 HPLC檢測(cè)結(jié)果

分離得到的多穗柯黃酮結(jié)晶的HPLC檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明，保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品根皮苷(phloridzin)一致，純度達(dá)到99.87%，推斷其與根皮苷分子有非常相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.1.2 ESI-MS檢測(cè)結(jié)果

圖2 多穗柯三葉苷ESI-MS圖－Fig.2 ESI-MS spectrum of ion [M-H]－of trilobatin separated from Lithocarpus polystachyus Rehd

如圖2所示，峰435m/z是根皮苷的負(fù)離子準(zhǔn)分子峰[Ph－H]－(Ph=Phlridzin，根皮苷)；峰273m/z是根皮苷分子失去一個(gè)葡萄糖殘基的負(fù)離子峰[Ph－glucoside]－；峰471m/z 是含2個(gè)結(jié)合水的根皮苷準(zhǔn)分子峰[Ph·2H2O－H]－。這個(gè)三葉苷的ESI-MS結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品根皮苷結(jié)果完全一致(圖3A)。

2.1.3 NMR檢測(cè)結(jié)果

1.1H-NMR：

δ(H-2, H-6)=7.01, δ(H-3, H-5)=6.65；δ(H-3', H-5')=6.05；δ(H-β) = 2.77。

2.13C-NMR：

δ(C-1) = 131.4, δ(C-2, C-6) = 129.1, δ(C-3, C-5) = 115.0,δ(C-4) = 155.4；

δ(C-1') = 105.3, δ(C-2', C-6') = 163.9, δ(C-3', C-5') = 94.9,δ(C-4') = 163.3；

δ(C ＝ O) = 205.0, δ(C-α) = 45.6, δ(C-β) = 29.3；

δ(G-1) = 99.5, δ(G-2) = 73.0, δ(G-3) = 77.1, δ(G-4) =69.2, δ(G-5) = 76.4, δ(G-6) = 60.4。

上述測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道根皮素- 4′-β- D -葡萄苷測(cè)定結(jié)果一致，因此確定該化合物為根皮素- 4′-β- D -葡萄糖苷(trilobatin，trb)即三葉苷，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3(B)。

圖3 根皮苷(A)和三葉苷(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of phloridzin (A) and trilobatin (phloretin-4-β-D-glucoside) from Lithocarpus polystachyus Rehd (B)

2.2 三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制

2.2.1 與阿卡波糖和蘆丁的比較

圖4 阿卡波糖、三葉苷、蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制作用對(duì)比Fig.4 Inhibitory effects of trilobatin, acarbose, and rutin at a concentration level of 0.8 mg/mL onα-glucosidase (A) andα-amylase(B)

從圖4A可看出，多穗柯三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率明顯高于蘆丁，與阿卡波糖沒(méi)有明顯區(qū)別；對(duì)α-淀粉酶活性雖也有抑制作用，但抑制率卻明顯低于阿卡波糖(圖4B)。這說(shuō)明多穗柯三葉苷是一種較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制劑和較弱的α-淀粉酶抑制劑。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度三葉苷、阿卡波糖和蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

由圖5可見(jiàn)，隨著三葉苷質(zhì)量濃度的增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性也隨之上升，至0.8mg/mL時(shí)達(dá)到最高，說(shuō)明三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性是劑量依賴(lài)型的。比較不同質(zhì)量濃度三葉苷、阿卡波糖和蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性可看出，隨質(zhì)量濃度增加，三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的上升速度快于蘆丁，但稍慢于阿卡波糖。三葉苷抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值為0.37mg/mL，也是介于阿卡波糖(0.28mg/mL)和蘆丁(0.45mg/mL)之間。

圖5 不同質(zhì)量濃度三葉苷、阿卡波糖和蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.5 Concentration dependent inhibitory effects of trilobatin,acarbose, and rutin on α-glucosidase

2.2.3 三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制機(jī)理

圖6 三葉苷抑制α-葡萄糖苷酶Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線(xiàn)圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot analysis of the inhibition kinetics of trilobatin on α-glucosidase

由圖6可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度的兩條三葉苷抑制曲線(xiàn)倒推相交于X軸負(fù)值區(qū)域，與典型的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制圖形完全一致，說(shuō)明三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.3 三葉苷對(duì)DPPH自由基清除能力

圖7 三葉苷、蘆丁、VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH radical scavenging activity of VC,trilobation and rutin

由圖7可見(jiàn)，隨著質(zhì)量濃度增加，三葉苷對(duì)DPPH自由基的清除活性也隨之上升，質(zhì)量濃度增加到1.2mg/mL時(shí)，清除DPPH自由基活性達(dá)到最高，與VC相當(dāng)，高于蘆丁，之后不再上升。這說(shuō)明多穗柯黃酮三葉苷有較強(qiáng)的抗氧化活性，而且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)型。三葉苷、VC和蘆丁清除DPPH自由基活性的IC50值分別為0.57、0.24、0.72mg/mL，三葉苷的IC50值雖然低于VC，但還是比蘆丁高。因此多穗柯黃酮三葉苷是一種較好的天然抗氧化劑。

3 結(jié) 論

多穗柯黃酮三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性都有明顯的抑制作用；與阿卡波糖一樣有很強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，而對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用卻明顯弱于阿卡波糖；三葉苷還具有較強(qiáng)的抗氧化能力。從上述研究結(jié)果看，多穗柯黃酮三葉苷對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性都有明顯的抑制作用，與糖尿病治療藥物阿卡波糖比較，與阿卡波糖一樣有很強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，而對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用卻明顯弱于阿卡波糖，加上三葉苷還具有較強(qiáng)的抗氧化能力，多穗柯黃酮三葉苷是一個(gè)值得進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的抗糖尿病天然活性物質(zhì)。

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Inhibitory Potential of Trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd against Key Enzymes Linked to Type ⅡDiabetes and Its Antioxidant Activity

ZHANG Yi1，NING Zheng-xiang1,*，DONG Huang-qiang2
(1. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China；2. Department of Food Science, Foshan University, Foshan 528231, China)

The inhibitory effects of trilobatin separated from Lithocarpus polystachyus Rehd on the activities of α-glucosidase and α-amylase were determined and compared with those of the anti-diabetic drug acarbose as a positive control and the type of the enzymatic inhibition on α-amylase was investigated. Also, rutin was used as a positive control to measure the ability of the trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd to scavenge DPPH free radicals. The results showed that α-glucosidase activity was inhibited remarkably by the trilobatin, and the inhibition was noncompetitive and did not exhibit a significant difference when compared to acarbose. Its inhibition rate against α-amylase, however, was lower than that of acarbose despite of having stronger DPPH free radical scavenging effect than rutin. From these experimental results, a conclusion could be drawn that the trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd is a potential anti-diabetic compound.

trilobatin；Lithocarpus polystachyus Rehd；α-glucosidase；α-amylase；diabetes

Q946.83

A

1002-6630(2011)05-0032-04

2010-07-05

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8152800001000023)

張毅(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：zhangyi85518@yahoo.com.cn

*通信作者：寧正祥(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。E-mail：fezhning@scut.edu.cn