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    動態(tài)濁度法定量檢測毛冬青注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素

    2011-10-17 12:30:16廣東省韶關(guān)市藥品檢驗所512024王莉蓓陳華龍嚴(yán)曉明姜麗君
    首都食品與醫(yī)藥 2011年4期
    關(guān)鍵詞:稀釋液內(nèi)毒素附表

    廣東省韶關(guān)市藥品檢驗所(512024)王莉蓓 陳華龍 嚴(yán)曉明 姜麗君

    筆者通過動態(tài)濁度法定量檢測毛冬青注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量,建立毛冬青注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析的方法。

    1 材料與儀器

    毛冬青注射液(批號:090101、090106、090908,規(guī)格:2ml/支,含毛冬青提取物40mg,廣東省博羅先鋒藥業(yè)集團(tuán)有限公司);動態(tài)濁度鱟試劑(批號0807252,1.25 ml/支,湛江安度斯生物有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號:150601-200861,150/支,中國藥品生物制品檢定所);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(批號:0809080,5ml/支,湛江安度斯生物有限公司);BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(天津大學(xué)無線電廠)(檢測光源405nm);ZH-2型漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)。METTLER TOLEDOsevenEasy pH酸度計(梅特勒);UV-2550型紫外分光光度計(島津)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 按細(xì)菌內(nèi)毒素限值公式L=K/M,K為人用每kg體重每1h最大可接受的內(nèi)毒素劑量,非放射性注射劑的K值為5.0 Eu/kg·h,M為1h內(nèi)每kg體重最大給藥劑量。毛冬青注射液用量一次2ml,其L值為L=K/M=5/2/60=150Eu/ml。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及可靠性[2]用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解稀釋,使其最終內(nèi)毒素濃度分別為5.0,1.0,0.2,0.04Eu/ml稀釋系列。各取0.2ml分別加到預(yù)先加有0.1ml動態(tài)濁度鱟試劑反應(yīng)管內(nèi),混合均勻。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測,其中每一濃度做2支平行管,并同時做2支陰性對照管(NC)。結(jié)果見附表1。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為 lgT=2.7465±0.22252lgC,r=0.9931,|r|>0.980。標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)λ1=0.04 Eu/ml,陰性對照內(nèi)毒素均小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn),標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

    附表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗

    2.3 干擾實驗

    2.3.1 供試品最大稀釋倍數(shù)計算[2]按公式MVD=L·C/λ,毛冬青注射液的L=150Eu/ml,C為1.0ml/ml,選取0.04~5.0Eu/ml的范圍測試。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度λ1為0.04Eu/ml,其最大稀釋倍數(shù)均為MVD=150·1.0/0.04=3750

    2.3.2 供試品溶液配制及干擾預(yù)實驗 將毛冬青注射液(批號090101),用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600,1∶3200等比系列稀釋液,作為供試品空白管(Et)。同時另分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2λ(λ為中點(diǎn)濃度0.5Eu/ml)和供試品各等比系列的2倍濃度稀釋液,在稀釋用試管中等量混合,得到在此稀釋倍數(shù)下含λm內(nèi)毒素的供試品溶液,作為供試品陽性管(Es)。分別取上述溶液各0.2ml加入預(yù)先加有0.1ml動態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi),混合均勻。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測,其中每一濃度做2支平行管,并同時做2支陰性對照管(NC),2支陽性對照管(PC),計算回收率?;厥章剩?)=Es-Et/λ×100%,結(jié)果見附表2、附表3。

    從附表2、3中可見,供試品等比稀釋液中,1∶200,1∶400,1∶800,稀釋液的回收率分別為513%、352%、96%。稀釋液1:1600,1:3200,稀釋液的回收率分別為107%和85%。1:1600,1:3200的回收率均在50%~200%,符合《中國藥典》規(guī)定。在日常檢查中,選1:3200稀釋液。

    附表2 毛冬青注射液預(yù)干擾實驗結(jié)果

    附表3 毛冬青注射液預(yù)干擾實驗結(jié)果

    2.4 定量檢查 根據(jù)以上預(yù)干擾實驗結(jié)果,對3批毛冬青注射液以1:3200稀釋液進(jìn)行定量檢查。見附表4。

    2.4.1 干擾影響的試驗 毛冬青注射液在日常檢查中其回收率要在有效范圍時,其稀釋倍數(shù)為1:3200。而供試品對檢測光源的吸收及pH值對試驗有一定影響。對檢測光源的吸收試驗:檢測光源的波長為405nm。毛冬青注射液(批號批號:090101)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成本次實驗系列濃度,用島津UV-2550型紫外分光光度計定點(diǎn)405nm波長處測定吸收值。pH值試驗:毛冬青注射液(批號批號:090101)原液及本次實驗系列濃度,結(jié)果見附表5。

    附表4 毛冬青注射液定量檢查結(jié)果

    附表5 毛冬青注射液對檢測光源的吸收試驗及pH值試驗

    3 討論

    3.1 中藥注射液對對檢測光源有吸收,引起干擾。如毛冬青注射液,在對檢測光源的吸收試驗結(jié)果可見,毛冬青注射液在50~1600倍稀釋液對檢測光源405nm有較大的吸收作用,故光源吸收是主要的干擾原因。建議在做中藥注射液細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法檢測時,根據(jù)其最大稀釋倍數(shù)配成等比系列,首先在檢測光源405nm進(jìn)行檢測,通過對檢測光源的吸收試驗,快速篩選出試驗濃度范圍。

    3.2 中藥注射劑成分復(fù)雜,含β-葡聚糖類似內(nèi)毒素物質(zhì),用動態(tài)濁度法定量檢測時,要觀察反應(yīng)曲線,考察樣品的干擾,可判定是類似內(nèi)毒素物質(zhì)的反應(yīng),還是供試品自身的內(nèi)毒素反應(yīng)。

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