黃蜀葵膠中的糖分析

王雪梅，施文婷，吳迷迷，汪瑩瑩

(安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，安徽省綠色高分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230039)

黃蜀葵膠中的糖分析

王雪梅，施文婷，吳迷迷，汪瑩瑩

(安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，安徽省綠色高分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230039)

目的：分析不同來源的黃蜀葵膠中的糖含量、多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其單糖組成。方法：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定4種黃蜀葵膠中還原糖、總糖和總多糖的含量，并解析其紅外吸收光譜圖；凝膠滲透色譜法測(cè)定純化后的4種多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，氣相色譜法分析其單糖組成。結(jié)果：4種黃蜀葵膠的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為51.07%、9.00%、53.94%和11.46%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為79.95%、78.99%、91.98%和61.13%，總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為28.88%、69.99%、38.04%和49.67%；紅外譜圖顯示AMG-1、AMG-3中主要含α-D-吡喃葡萄糖，AMG-2和AMG-4中主要含有甘露糖；4種黃蜀葵膠中多糖的峰值相對(duì)分子質(zhì)量分別為3.91×103、5.36×105、3.87×103和5.12×105；4種樣品均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)量之比分別為0.42:1.00:0.27、1.00:0.15:0.54、0.27:1.00:0.15和1.00:0.12:0.48。結(jié)論：不同來源的黃蜀葵膠在還原糖、總糖和總多糖的含量，多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其單糖組成上均存在較大差異。

黃蜀葵膠；糖；含量；相對(duì)分子質(zhì)量；組成

黃蜀葵膠(Abelmoschus manihotgum，簡(jiǎn)稱AMG)是一種新型食品膠，系以錦葵科植物黃蜀葵根、莖經(jīng)過整理、清洗、干燥、切碎、磨粉、過篩、精制而得，其外觀為淡棕黃色或帶綠色粉末，主要成分為黃蜀葵多糖，是一種較為豐富的可再生天然高分子資源，具有可降解性、生物相容性及安全性等特點(diǎn)，在食品工業(yè)中用作增稠劑和穩(wěn)定劑。目前有關(guān)黃蜀葵膠的研究?jī)H限高素蓮等[1]對(duì)其多糖的分析，他們采用熱水浸提、乙醇沉淀、鞣酸除蛋白，過氧化氫和活性炭脫色，微晶纖維素柱色譜分離，從黃蜀葵的根和莖中制備出多糖，并采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定了多糖含量，薄層色譜法鑒定該多糖中含有半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖3種單糖組分，紅外吸收光譜法分析鑒定黃蜀葵多糖的糖苷鍵為α-吡喃糖苷鍵，并測(cè)定了其比旋光度。但對(duì)黃蜀葵膠及其多糖的深入研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

通常食品膠品質(zhì)的優(yōu)劣主要取決于其中糖的含量尤其是水溶性多糖的含量、多糖的相對(duì)分子質(zhì)量以及多糖中單糖的組成。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)幾種不同來源的黃蜀葵膠的糖含量、多糖的相對(duì)分子質(zhì)量及其單糖組成進(jìn)行分析，并解析其紅外譜圖，以期從本質(zhì)上了解黃蜀葵膠的物性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黃蜀葵膠樣品：AMG-1 山東濰坊進(jìn)出口食品有限公司；AMG-2 河南鄭州世紀(jì)安華食品配料有限公司；AMG-3、AMG-4 河南鄭州海特食品有限公司。

無水亞硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、氯仿、正丁醇、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、溴化鉀、氯化鈉(均為分析純)；3,5-二硝基水楊酸(DNS)、三氟乙酸(均為化學(xué)純)；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(Dextran T)T-500、T-200、T-70、T-40 和 T-10(Mr分別為500000、200000、70000、40000和10000) Pharmacia公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品阿拉伯糖(D-Ara)、甘露糖(D-Man)、葡萄糖(DGlc)、半乳糖(D-Gal)(均為生化試劑) 上海源聚生物科技有限公司；蒸餾水、超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)熱電公司；RI-230型凝膠滲透色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；CP-3800氣相色譜儀 美國(guó)瓦里安公司。

1.2 還原糖和總糖含量測(cè)定

1.2.1 DNS試液的配制[2]

稱取6.3g DNS和21g氫氧化鈉，加到500mL含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g苯酚和5g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中，7d后使用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1g，溶解后定容于100mL容量瓶中。分別移取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于25mL比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至1mL；再加入3mL DNS試劑，混勻，置沸水浴中煮沸10min，流水迅速冷卻，定容搖勻。以試劑空白為參比，在450～580nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，選擇最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.3 還原糖含量的測(cè)定

精確稱取干燥后的AMG系列樣品各0.1g，加水溶解后分別定容于100mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取上述溶液各1.0mL，分別置于25mL比色管中，再各加3mL DNS試劑，按1.2.2節(jié)方法測(cè)定。

1.2.4 總糖含量的測(cè)定

取1.2.3節(jié)中配制的試液各30mL，分別置于250mL三角瓶中，加入稀鹽酸(V濃鹽酸:V水=1:2)10mL，置沸水浴中30min，取出冷卻后，加20g/100mL氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，移入100mL容量瓶中，定容。精密量取上述溶液各1.0mL，分別置于25mL比色管中，再各加3mL DNS試劑，按1.2.2節(jié)方法測(cè)定。

1.3 紅外吸收光譜測(cè)定

分別取干燥的AMG試樣約1mg，與約100mg的溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨至混合均勻，在油壓機(jī)上壓制成透明的薄片，然后進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，掃描范圍為4000～400cm-1。

1.4 黃蜀葵膠的純化

配制質(zhì)量濃度為1g/100mL的AMG系列溶液，向該溶液中加入1/4體積的Sevag試劑(V氯仿:V正丁醇=4:1)，劇烈振蕩20～30min后靜置30min，然后離心除去沉淀，再重復(fù)上述操作，至離心管中無變性蛋白，且紫外檢測(cè)在260～280nm波長(zhǎng)處無蛋白吸收峰[3-4]。將純化后的樣品真空干燥，制得AMG系列純多糖樣品。

1.5 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran T系列在下述色譜條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定4種純多糖在相同色譜條件下的色譜圖及保留時(shí)間，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出該多糖的相對(duì)分子質(zhì)量[5-6]。

色譜條件：色譜柱：TSK-GEL G4000PWxl 7.8mm(i.d.)×300mm凝膠色譜柱；柱溫45℃；流動(dòng)相0.1mol/L NaCl溶液，流速0.9mL/min；柱壓2.0MPa；溶液質(zhì)量濃度為5mg/mL，進(jìn)樣量20μL。

1.6 單糖組成分析

1.6.1 色譜條件

CP-Sil24CB毛細(xì)管色譜柱，內(nèi)徑0.32mm，柱長(zhǎng)30m，液膜厚度0.25μm，涂層材料50%苯基甲基聚硅氧烷。進(jìn)樣口溫度270℃；載氣為高純氮?dú)?，流?8mL/min，氫氣流速30mL/min，空氣流速300mL/min；進(jìn)樣量2μL，分流比為1/25；氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度300℃。柱溫采用程序升溫，先在140℃保持1min，然后以10℃/min的速度升至250℃，保持3min。

1.6.2 單糖衍生物的制備[7]

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)單糖各10mg于25mL水解管中，分別加入10mg鹽酸羥胺，1.0mL吡啶，在90℃水浴振蕩反應(yīng)30min，冷卻至室溫后，分別加入1.0mL乙酸酐，90℃水浴繼續(xù)反應(yīng)60min，生成的糖腈乙酸酯衍生物，直接注入GC分析。

1.6.3 多糖的水解和衍生[8-10]

稱取純化后的AMG系列多糖樣品各10.0mg于具塞試管中，各加入2mol/L三氟乙酸4mL，充氮?dú)夥夤芎笥?20℃水解4～6h。取出于65℃水浴中用氮?dú)獯蹈?。將上述水解后的多糖，按?.6.2節(jié)衍生條件，依次加入一定量的內(nèi)標(biāo)及各種試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)行GC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃蜀葵膠中還原糖、總糖和總多糖的含量

在堿性條件下加熱，還原糖被氧化成糖酸等產(chǎn)物，DNS則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與該物質(zhì)顏色深淺呈正比。單糖都是還原糖，多糖可用酸水解使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖含量(還原糖以葡萄糖含量計(jì))，以總糖含量減去還原糖含量，即為總多糖的含量[11]。本實(shí)驗(yàn)中各標(biāo)準(zhǔn)樣及待測(cè)樣在紫外-可見吸收光譜圖上的最大吸收峰均出現(xiàn)在490nm處，因此取490nm處的吸光度A和相對(duì)應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度c作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線性方程：A＝0.02896c－0.0144，相關(guān)系數(shù)r＝0.9990。結(jié)果表明葡萄糖在4～40mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。4種黃蜀葵膠中還原糖、總糖及總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

表1 黃蜀葵膠樣品中糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Mass fractions of saccharides in AMG samples %

2.2 紅外吸收光譜圖分析

圖1 黃蜀葵膠的紅外譜圖Fig.1 Infrared spectra of AMG samples

圖1 為4種黃蜀葵膠的紅外吸收光譜圖，由圖可知，3430、2927cm-1和1639cm-1分別為多糖的O—H、C—H伸縮振動(dòng)吸收峰和O—H彎曲振動(dòng)吸收峰；1145cm-1和1020cm-1的特征峰為C—O、C—O—C的伸縮振動(dòng)和C—O—H的彎曲振動(dòng)吸收。AMG-1和AMG-3在833cm-1有弱的吸收峰，表明含α-糖苷鍵，930cm-1和770cm-1兩弱的吸收峰標(biāo)示葡萄糖的絕對(duì)構(gòu)型，為α-D-吡喃葡萄糖；AMG-2、AMG-4在807cm-1和867cm-1附近有兩弱吸收峰，則表明含甘露糖苷鍵[12-14]。

2.3 黃蜀葵多糖的相對(duì)分子質(zhì)量

在相應(yīng)的色譜條件下，測(cè)得各色譜峰保留時(shí)間，以不同相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的保留時(shí)間(tR)為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)值(lgMr)為縱坐標(biāo)作圖(圖2)即可得到GPC校正曲線[15-16]。線性方程為lgMr= 8.261 －0.411tR，R2=0.9902。圖3為純化后黃蜀葵膠樣品的GPC圖，4種樣品的保留時(shí)間分別為11.36、6.16、11.37min和6.21min；根據(jù)GPC校正曲線及各多糖樣品的保留時(shí)間，計(jì)算出其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值，經(jīng)轉(zhuǎn)換即得出4種純多糖樣品AMG-1、AMG-2、AMG-3和AMG-4的峰值相對(duì)分子質(zhì)量分別為3.91×103、5.36×105、3.87×103和5.12×105。

圖2 葡聚糖的GPC校正曲線Fig.2 GPC calibration curve of dextran

圖3 純化后AMG樣品的凝膠滲透色譜圖Fig.3 Gel permeation chromatograms of purified AMG samples

2.4 單糖組成的氣相色譜分析

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatograms of glycosyl-nitrile-acetate derivatives for standard monosaccharides

圖4 為混合標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖。由圖可見，4種單糖均得以良好分離，保留時(shí)間分別為D-Ara 7.68min、D-Man 9.95min、D-Glc 10.13min和D-Gal 10.32min。各多糖樣品水解后其單糖糖腈乙酸酯衍生化后的氣相色譜圖見圖5。在相同色譜條件下，保留時(shí)間可作為定性分析的依據(jù)，通過與圖4中標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間相比較，可確定4種AMG多糖樣品均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，不含阿拉伯糖。以阿拉伯糖為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，多糖中各單糖的物質(zhì)量之比均通過相對(duì)校正因子求得[17]，4種多糖中各單糖的物質(zhì)量之比見表2。

圖5 純化后AMG樣品糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatograms of purified AMG glycosyl-nitrile-acetate derivatives

表2 純化后AMG樣品中各單糖的物質(zhì)的量之比Table 2 Monosaccharide composition of purified AMG samples

3 結(jié) 論

3,5-二硝基水楊酸比色法可以同時(shí)測(cè)定還原糖和總糖含量，且在弱堿性條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境的污染相對(duì)較小，實(shí)用性較強(qiáng)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)探索，在水解溫度為120℃時(shí)，AMG-1和AMG-2的最佳水解時(shí)間為6h，AMG-3和AMG-4的最佳水解時(shí)間為4h。

采用中等極性的CP-Sil24CB毛細(xì)管色譜柱，在11min內(nèi)完成了4種單糖的分析，各單糖均能完全分離，分析過程中不產(chǎn)生異構(gòu)峰，重復(fù)性較好，精密度和回收率均較高，可為黃蜀葵膠中單糖組成的測(cè)定提供一種較為準(zhǔn)確可靠的分析方法。

由分析結(jié)果可知，幾種黃蜀葵膠樣品均由甘露糖、葡萄糖和半乳糖3種單糖組成，其還原糖、總糖和總多糖含量均不相同，多糖的相對(duì)分子質(zhì)量也不相同，各單糖的物質(zhì)量之比相差較大。與文獻(xiàn)[1]報(bào)道不同，4種AMG樣品均未檢出阿拉伯糖和鼠李糖，可見不同來源的黃蜀葵多糖在單糖組成上均存在較大差異。

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Saccharide Analysis of Abelmoschus manihot Gum

WANG Xue-mei，SHI Wen-ting，WU Mi-mi，WANG Ying-ying
(Key Laboratory of Environment-Friendly Polymer Materials of Anhui Provice, College of Chemistry and Chemical Engineering,Anhui University, Hefei 230039, China)

Objective: To analyze the contents of saccharides, the molecular weights of polysaccharides and monosaccharide composition ofAbelmoschus manihotgum (AMG) from four different sources. Methods: The contents of reducing sugars, total saccharides and polysaccharides in four kinds of AMG samples were determined by 3,5-dinitros-alicylic acid (DNS) colorimetric method. Infrared spectra (IR) of AMG samples were also analyzed. The molecular weights of polysaccharides in purified AMG samples were characterized by gel permeation chromatography (GPC), and the monosaccharide composition of AMG samples were analyzed by gas chromatography (GC). Results: The contents of reducing sugars were 51.07%, 9.00%, 53.94%and 11.46%, respectively; the contents of total saccharides were 79.95%, 78.99%, 91.98% and 61.13%, respectively; and the contents of polysaccharides were 28.88%, 69.99%, 38.04% and 49.67%, respectivly, in four kinds of AMG samples. Infrared spectra indicated that AMG-1 and AMG-3 were mainly composed ofα-D-glucopyranose, while AMG-2 and AMG-4 were mainly composed of mannose. The peak molecular weights of AMG polysaccharides were 3.91 × 103, 5.36 × 105, 3.87 × 103and 5.12 × 105, respectivly. All four kinds of AMG samples contained mannose, glucose and galactose; and their molar ratios were 0.42:1.00:0.27, 1.00:0.15:0.54, 0.27:1.00:0.15 and 1.00:0.12:0.48, respectivly. Conclusion: The contents of reducing sugars, total saccharides and polysaccharides, the molecular weights of polysaccharides and monosaccharide composition apparently differ among AMG gums from different sources.

Abelmoschus manihotgum；saccharide；content；molecular weight；composition

O657

A

1002-6630(2011)06-0256-05

2010-05-05

王雪梅(1964—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分析與應(yīng)用。E-mail：wangxm929@yahoo.com.cn