蛋清肽及肽鈣配合物的制備

韓 櫻，何 慧*，馬芝麗，張文君，李江濤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

蛋清肽及肽鈣配合物的制備

韓 櫻，何 慧*，馬芝麗，張文君，李江濤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

為獲得高生物效價(jià)的補(bǔ)鈣制劑及提高蛋清蛋白的附加值，首先對(duì)雞蛋清進(jìn)行酶法改性，篩選實(shí)驗(yàn)用酶，采用正交試驗(yàn)，分別對(duì)酶解條件及肽鈣反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用紅外光譜法比較反應(yīng)前后圖譜的變化。結(jié)果表明：選擇先堿性蛋白酶后中性蛋白酶進(jìn)行雙酶酶解，酶解條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、堿性酶酶底比1:100、pH8.0、酶解時(shí)間3h；中性酶酶底比1:25、pH7.0、酶解時(shí)間3h。制備肽鈣配合物最優(yōu)反應(yīng)條件為肽鈣(CaCl2)質(zhì)量比2.5:1、pH9.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、溫度55℃，在此條件下，可溶性鈣含量為21.15mg/L，水解度為8.66%。制備蛋清肽時(shí)，使用雙酶的水解效果優(yōu)于單酶，蛋清肽與鈣形成了雙單齒配合物，其鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.75%。

蛋清肽；肽鈣配合物；酶解；制備

我國(guó)是世界上最大的蛋品生產(chǎn)國(guó)，但目前的禽蛋加工水平較低，技術(shù)陳舊，由于我國(guó)的某些飲食習(xí)慣和一些行業(yè)的特殊需求，對(duì)蛋黃的需求量較大，如何利用蛋清，并提高其附加值，是值得研究的課題。成熟的蛋白酶酶解技術(shù)為蛋清深加工開(kāi)啟了一扇新大門(mén)[1]。目前，活性肽是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，而人們對(duì)蛋清活性肽的研究與酪蛋白活性肽相比，還較少。

鈣營(yíng)養(yǎng)不足是當(dāng)今全球性的健康問(wèn)題，據(jù)有關(guān)報(bào)道，中國(guó)人普遍缺鈣，雖然近幾年國(guó)內(nèi)補(bǔ)鈣產(chǎn)品越來(lái)越多，銷量也年年增加，可是國(guó)民缺鈣的狀況卻沒(méi)有得到根本的改善，究其原因在于鈣的生物利用率不高。因?yàn)槭澄镏械闹菜?、草酸和磷酸等成分在腸道中易與攝入的鈣形成不溶性的植酸鹽、草酸鹽和磷酸鹽，導(dǎo)致鈣的生物利用率下降。而蛋白質(zhì)經(jīng)水解后得到的小肽，能與鈣形成可溶性配合物，維持鈣在小腸內(nèi)的溶解狀態(tài)，增加小腸對(duì)鈣的吸收及其在體內(nèi)的蓄積。有研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸、肽等化合物能與鈣形成可溶性配合物，可以阻止小腸內(nèi)鈣的沉淀，從而很好地促進(jìn)鈣吸收。如酪蛋白磷酸肽[2]和卵黃高磷蛋白磷酸肽[3]，其肽鏈中的磷酸絲氨酸殘基可以與鈣結(jié)合形成可溶性復(fù)合物。此外，也有研究表明，不含磷酸基團(tuán)的肽也能與鈣結(jié)合形成可溶性復(fù)合物[4]。

目前關(guān)于蛋清肽的生物活性研究主要集中在降血壓[5]、抗氧化、增強(qiáng)免疫[1]等方面，而對(duì)于肽鈣配合物的研究多集中在水產(chǎn)品[6]、動(dòng)物骨頭[7]及卵黃[8]中，對(duì)于蛋清肽鈣配合物的制備及其促進(jìn)鈣吸收的作用研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以雞蛋清為原料，通過(guò)酶水解制備蛋清肽后再與鈣進(jìn)行絡(luò)合，旨在制備鈣結(jié)合率較高的可溶性配合物，為充分利用蛋清資源，并提高其附加值，開(kāi)發(fā)出新的生物利用率高的補(bǔ)鈣產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 市購(gòu)。

Neutrase中性蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國(guó)Amresco進(jìn)口分裝；木瓜蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

無(wú)水氯化鈣、鄰甲酚酞絡(luò)合酮、8-羥基喹啉、硼酸、乙醇胺、N a O H、9 5%乙醇、溴化鉀、乙二胺四乙酸二鈉、鈣紫紅素(均為國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯股份公司；TDL-5A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV-2000分光光度計(jì) 尤尼科(上海)有限公司；Nexus 470 FT-IR型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；ALPHA 1-4LD真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 單酶法制備蛋清肽

將雞蛋洗凈，打蛋分離蛋清，冷凍干燥后研磨制得蛋清粉。加入不同的酶，在其各自適宜的條件下酶解4h，沸水浴滅酶10min，離心得到上清液。5組酶及其水解實(shí)驗(yàn)條件分別為中性蛋白酶(酶底比1:50、pH7.0、50℃水解4h)、堿性蛋白酶(酶底比1:100、pH8.0、55℃水解4h)、胃蛋白酶(酶底比1:50、pH2.0、40℃水解4h)、胰蛋白酶(酶底比1:50、pH7.5、45℃水解4h)、木瓜蛋白酶(酶底比1:50、pH7.0、45℃水解4h)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.2 雙酶法制備蛋清肽

根據(jù)單酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)4組雙酶水解實(shí)驗(yàn)。先加入一種酶，在其最適條件下水解2 h，沸水浴滅酶10min，再加入第二種酶，在最適條件下再水解2h，沸水浴滅酶10min，離心后制酶解物。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.3 鈣結(jié)合實(shí)驗(yàn)

酶篩選是以可溶性鈣結(jié)合量和水解度為測(cè)定指標(biāo)，首先，對(duì)蛋清水解液進(jìn)行鈣結(jié)合實(shí)驗(yàn)，參考Sato等[9]的方法，并略做修改：在具塞試管中加入少量5mmol/L CaCl2和過(guò)量的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)，再加入一定量的蛋清水解液，置于恒溫加熱磁力攪拌器中37℃溫育2h，取出后8000r/min常溫離心10min，采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法[10-11]測(cè)定上清液中的可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.4 水解度的測(cè)定

參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.3.5 雙酶法制備蛋清肽的正交優(yōu)化設(shè)計(jì)

選定底物濃度、第一種酶的酶底比及酶解時(shí)間、第二種酶的酶底比及酶解時(shí)間5個(gè)因素，每個(gè)因素確定4個(gè)水平，以可溶性鈣結(jié)合量和水解度為指標(biāo)，進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)，其因素水平表見(jiàn)表1。

表1 雙酶法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing enzymatic modification of egg white

1.3.6 蛋清肽鈣配合物的制備

以上述蛋清水解液為原料，在一定溫度下調(diào)節(jié)pH值，按一定比例加入CaCl2，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后取出，加入乙醇使其體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%，離心沉淀，乙醇洗滌沉淀數(shù)次，55℃烘干或真空冷凍干燥，制得蛋清肽-Ca2+產(chǎn)品。

1.3.7 蛋清肽鈣配合物制備的正交設(shè)計(jì)

選定肽鈣質(zhì)量比、pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，以產(chǎn)物中鈣元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為測(cè)定指標(biāo)，按L9(34)正交表安排四因素三水平試驗(yàn)(表2)，反應(yīng)時(shí)間均為20min。

表2 蛋清肽鈣配合物制備工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing preparation of calcium-chelating egg white peptide

1.3.8 產(chǎn)物鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

一定質(zhì)量的產(chǎn)物(已烘干)→溶解(可加酸和適當(dāng)加熱)→定容至25mL→取出一定量，加入掩蔽劑三乙醇胺，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，用EDTA標(biāo)液滴定(作3個(gè)平行)，按下式計(jì)算鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)[13-14]：

式中：C為標(biāo)定得EDTA濃度/(mol/L)；V為消耗的EDTA體積/mL；40為鈣的相對(duì)摩爾質(zhì)量/(g/mol)；m為制得的復(fù)合物質(zhì)量/g。

1.3.9 紅外光譜法

取蛋清肽及蛋清肽鈣配合物各2mg與200mg KBr混合，在紅外光下磨成2.5μm的薄片，在30MPa條件下制成透明的KBr薄片。在500～4000cm-1條件下用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行定性分析，分別得到其紅外光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種單酶的酶解比較

表3 5種單酶的酶解實(shí)驗(yàn)比較Table 3 Comparison of egg white hydrolyzed by five kinds of enzymes alone

由表3可知，可溶性鈣結(jié)合量從高到低依次為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解物；水解度由高到低依次為胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶酶解物，沒(méi)有一種酶的酶解液中可溶性鈣結(jié)合量和水解度兩項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)較高，故考慮選擇兩種酶進(jìn)行雙酶酶解。可溶性鈣結(jié)合量是優(yōu)先考慮的指標(biāo)，所以選擇中性蛋白酶或木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，以獲得較高的可溶性鈣結(jié)合量，但這兩種酶的水解度均很低。這與它們的酶切位點(diǎn)相關(guān)，酶的專一性使得它們只能作用于特定的位點(diǎn)，不能充分打開(kāi)蛋清蛋白的肽鏈，因而水解度很低，故可以考慮采用雙酶復(fù)合水解的方法來(lái)改善。

2.2 4組雙酶的酶解效果比較

從酶解肽需與鈣離子結(jié)合的角度考慮，若肽段太長(zhǎng)，即水解不充分，由于空間位阻效應(yīng)會(huì)影響其與鈣的結(jié)合，因此要提高蛋清肽的水解度；而經(jīng)胃蛋白酶水解后較堿性蛋白酶的可溶性鈣含量低，另一方面胃蛋白酶是動(dòng)物性蛋白酶，較堿性蛋白酶要貴的多，所以將水解度較高的堿性蛋白酶分別與中性蛋白酶、木瓜蛋白酶(表3)進(jìn)行兩兩組合的雙酶實(shí)驗(yàn)(表4)。先堿性蛋白酶后木瓜蛋白酶處理，其效果與先堿性蛋白酶后中性蛋白酶處理差別不大，考慮到商業(yè)化酶制劑中中性蛋白酶及堿性蛋白酶具有較好的質(zhì)量和穩(wěn)定性，故選擇先堿性蛋白酶，后中性蛋白酶的組合進(jìn)行雙酶水解。

表4 4組雙酶的酶解比較結(jié)果Table 4 Comparison of egg white hydrolyzed by four dual enzyme combination

2.3 雙酶法(先堿性蛋白酶后中性蛋白酶)酶解的正交試驗(yàn)

表5 雙酶酶解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 5 Scheme and experimental results of the first orthogonal array design

采用極差分析法[15]對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行分析，由表5可以看出，各因素對(duì)可溶性鈣含量的影響大小順序?yàn)橹行悦该附鈺r(shí)間＞堿性酶酶解時(shí)間＞堿性蛋白酶[E]/[S]＞中性蛋白酶[E]/[S]＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即影響可溶性鈣含量的主要因素是兩種酶的酶解時(shí)間，其次才是堿性蛋白酶的酶底比。由此得到的最佳酶解條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、堿性蛋白酶酶底質(zhì)量比1:100、溫度55℃、pH8.0條件下水解時(shí)間3h；再以酶底質(zhì)量比1:25加入中性蛋白酶，控制溫度50℃、pH7.0水解時(shí)間3h。在此最佳酶解條件下制備蛋清肽，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，測(cè)得其可溶性鈣含量為21.15mg/L，水解度為8.66%；Jung等[16]用酶解法研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度250mg/L的鱈魚(yú)骨肽溶液中可得28.78mg/L可溶性鈣；本研究可溶性鈣結(jié)合量與鱈魚(yú)骨肽的此指標(biāo)接近。

2.4 蛋清肽鈣配合物制備的正交試驗(yàn)

表6 蛋清肽鈣復(fù)合物制備的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Scheme and experimental results of the second orthogonal array design

由表6可知，影響蛋清肽鈣配合物制備的各因素的主次順序?yàn)閜H值＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞溫度＞肽鈣(CaCl2)質(zhì)量比；其最優(yōu)水平組合為pH9.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、溫度55℃、肽鈣(CaCl2)質(zhì)量比2.5:1。此最優(yōu)組合未在正交組合內(nèi)，經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此條件下制得的肽鈣配合物中的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以達(dá)到8.75%。而王飛等[8]采用原子吸收法對(duì)3種不同酶系組合制備的卵黃高磷蛋白磷酸肽鈣樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.446%、10.35%與11.375%；郭艷[17]利用酸水解法處理米渣蛋白制備得到的氨基酸鈣螯合物，其鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.83%，本研究獲得的蛋清肽鈣配合物的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與之接近。

2.5 紅外結(jié)構(gòu)分析

比較圖1、2的變化，可以發(fā)現(xiàn)，3421cm-1處的吸收峰變成了3402、3288cm-1的雙峰，推測(cè)是肽鏈或側(cè)鏈上的NH3+丟失1個(gè)質(zhì)子后成為－NH2，所以出現(xiàn)雙峰，－NH2可與Ca2+配位。比較反應(yīng)前后的圖譜發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)后在1543cm-1處新出現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)吸收峰，且在1410cm-1處也有峰，這與羧酸成鹽后的變化相一致，1543cm-1為羧酸根的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1410cm-1為羧酸根的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，羧酸根的負(fù)離子處的氧具有配位能力。根據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，沒(méi)有與金屬離子配位的羧酸根離子的Δv為160cm-1左右，若配合物中的Δv與游離時(shí)的Δv差不多，則認(rèn)為是雙單齒形式配位。在本實(shí)驗(yàn)中肽鈣反應(yīng)后圖譜中羧酸根離子的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的峰和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰Δv=133cm-1，則可認(rèn)為鈣與羧基以雙單齒形式配位。

圖1 蛋清肽的紅外圖譜Fig.1 IR spectrum of egg white peptide

圖2 蛋清肽鈣配合物的紅外圖譜Fig.2 IR spectrum of calcium-chelating egg white peptide

3 結(jié)論與討論

采用先堿性蛋白酶再用中性蛋白酶的雙酶法水解制備有較高鈣結(jié)合能力的蛋清肽，可以與鈣生成可溶物，其可溶性鈣結(jié)合量為21.15mg/L；該肽與鈣的絡(luò)合反應(yīng)最佳條件為肽鈣(CaCl2)質(zhì)量比2.5:1、pH9.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、水浴溫度55℃攪拌反應(yīng)20min，制得鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.75%的雙單齒蛋清肽鈣配合物。

制備蛋清肽時(shí)，主要從生物利用率的角度考慮，以可溶性鈣結(jié)合量來(lái)優(yōu)化制備條件。小腸中有一些磷酸根離子、草酸根離子等易與鈣形成不溶物的陰離子，從而影響鈣的吸收利用。這種方法基于先讓鈣與磷酸鹽形成不溶物，再加入蛋清肽樣品，將其中的鈣奪取，使之生成可溶性的肽鈣配合物，此時(shí)鈣呈溶解狀態(tài)，再用鄰甲酚酞比色的方法來(lái)測(cè)這部分可溶性鈣的含量，這反映了蛋清肽與鈣的結(jié)合能力。肽鈣配合物作為補(bǔ)鈣劑的優(yōu)點(diǎn)在于：Ca2+在小腸pH值條件下易生成不溶物，降低了補(bǔ)鈣劑的生物可利用率，而絡(luò)合鈣的在腸道pH值條件下仍為可溶物，其生物可利用率提高；蛋清肽同時(shí)是營(yíng)養(yǎng)全面且易吸收的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑；蛋清肽還具有抗氧化等諸多生理調(diào)節(jié)作用。

制備蛋清肽鈣配合物時(shí)，肽與鈣直接反應(yīng)，制備時(shí)控制在堿性條件，使之絡(luò)合鈣量大大提高，與已報(bào)道的卵黃高磷蛋白的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(8.446%)[8]相當(dāng)。

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Preparation of Calcium-chelating Egg White Peptide

HAN Ying，HE Hui*，MA Zhi-li，ZHANG Wen-jun，LI Jiang-tao
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to develop a kind of calcium supplement with high bioavailability, and improve added value of egg white protein, egg white was enzymatically modified and then chelated with calcium. Enzyme screening for the modification of egg white showed that the optimum hydrolysis mode for egg white was sequential hydrolysis with alcalase and neutrase. After this,process optimization for the enzymatic modification of egg white and chelating reaction between modified egg white and calcium was conducted using orthogonal array design. The optimal conditions for the stepwise double enzymatic hydrolysis of egg white were substrate concentration of 6%, alcalase/substrate ratio of 1:100, hydrolysis pH of 8.0 and hydrolysis time of 3 h; neutrase/substrate ratio of 1:25, hydrolysis pH of 7.0 and hydrolysis time of 3 h. In addition, the optimal preparation conditions for calcium-chelating egg white peptide were the ratio between peptide and CaCl2 (m/m) of 2.5:1, reaction pH of 9.5, substrate concentration of 4%, and reaction temperature of 55 ℃. Under the optimal conditions, the yield of soluble calcium and degree of hydrolysis were 21.15 mg/L and 8.66%, respectively. Therefore, sequential dual-enzyme hydrolysis method is better than single-enzyme hydrolysis method for the preparation of egg white peptide. The obtained egg white peptides can form a kind of bridging bidentate complex with calcium. The calcium content in the calcium-chelating egg white peptide was up to 8.75%.

egg white peptide；calcium-chelating egg white protein；enzymolysis；preparation

TS253.9

A

1002-6630(2011)06-0110-05

2010-06-11

韓櫻(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：kekebeibeihy@126.com

*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn