表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的化學成分與纖維素結(jié)構(gòu)

宋永康 ，黃 薇，姚清華，陳麗華，劉文靜，李玥仁福建省農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室;福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建福州350003

水稻是我國重要的糧食作物，稻瘟病、紋枯病等真菌病害，是水稻生產(chǎn)的主要限制因素之一。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源抗病基因?qū)胨?，培育出抗病水稻新品種，是解決這一問題的有效途徑(張志忠等，2005)。幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖都是組成真菌細胞壁的主要碳水化合物，因此，起降解作用的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶在防御病原真菌侵害中具有重要作用。病原真菌細胞壁中幾丁質(zhì)的降解，能夠破壞細胞新物質(zhì)的沉積，致使病原體死亡，且其產(chǎn)生的細胞壁碎片具有誘導作用，從而刺激寄主植物產(chǎn)生抗病反應。β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶具有協(xié)同的抗真菌作用(王關(guān)林和方宏筠，2009)。另外，在抗病性研究中發(fā)現(xiàn)，植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗病性有關(guān)，如寄主植物表面蠟質(zhì)層的有無、角質(zhì)層和木栓層的厚薄、硅質(zhì)化的程度等。植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異可以對病原菌產(chǎn)生物理上的障礙，或通過誘導植物形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而機械地阻礙病原菌的侵染(董金皋和黃梧芳，1995)。已有研究表明，水稻秸稈由37%～40%纖維素、27%～30%半纖維素及5%～8%木質(zhì)素緊密交聯(lián)在一起而成，且秸稈纖維素具有較高的結(jié)晶度(彭維和向志明，2007)。而作為秸稈主要成分的纖維素，其含量和結(jié)構(gòu)，在抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻之間是否存在差別，是本研究主要關(guān)注的問題。本文通過化學法、傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)法以及X-射線衍射(X-ray diffractometer，XRD)方法分析了抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻中化學成分和纖維素結(jié)構(gòu)的變化情況，以期為進一步深入地研究轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻為表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及非轉(zhuǎn)基因七絲軟粘(對照)。其中，轉(zhuǎn)品8為雙價抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，導入水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24)和苜蓿葡聚糖酶基因(β-1、3-Glu);轉(zhuǎn)品1為三價抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，導入水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24、RCH10)以及水稻酸性幾丁質(zhì)酶基因(RAC22)。上述材料均由廣東海洋大學提供。

供試地點位于福州市閩侯縣良種場，地貌為閩江兩岸丘陵河谷區(qū)，屬南亞熱帶季風氣候。試驗水田面積約500 m2，為梯田形式，土壤為黃紅壤，土壤總碳含量 16.44 g·kg－1、總氮 1.15 g·kg－1、有效磷33.31 mg·kg－1、速效鉀 68.97 mg·kg－1，pH 5.56，分別種植早、晚兩季轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及對照。每個品種種植3個小區(qū)。

試驗所用秸稈為早稻收割后的轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及七絲軟粘的秸稈，采回的樣品葉片、葉鞘和莖分開，在105℃下殺青15 min，然后在80℃烘24 h，粉碎后60目過篩，裝入樣品袋存放于干燥器內(nèi)，待用。

1.2 秸稈的化學成分分析

采用 Soest et al.(1985、1991)的方法，測定秸稈的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、硅的總含量，可溶解硅的含量，硅的溶解效率。根據(jù)GB/T 6432－1994(國家技術(shù)監(jiān)督局，1994)，測定秸稈葉片、葉鞘、莖的粗蛋白質(zhì)含量。每個樣品設3個重復。

1.3 纖維素的紅外光譜分析

將樣品與適量溴化鉀(光譜純)磨細混勻并壓片，在傅立葉變換紅外光譜儀(尼高麗360智能型)上進行測定。光譜儀掃描波數(shù)4000～450 cm－1，分辨率為 0.5 cm－1，波數(shù)精度為 0.01 cm－1。根據(jù)測定得到的紅外光譜圖，按式(1)、(2)計算紅外結(jié)晶指數(shù)(葉君和熊犍，1999):

式中，A1429、A893、A1372、A2900分別為紅外光譜圖中波數(shù)為 1429、893、1372、2900 cm－1譜帶的吸光度。式(1)、(2)為經(jīng)驗公式，沒有明確的物理意義，但可用來表征纖維素結(jié)晶度的變化。

1.4 纖維素的X-射線衍射分析

采用菲力普公司生產(chǎn)的X-射線衍射儀(X'pert Pro MPD，Philip)對樣品進行分析。分析條件:采用Co靶，加速電壓40 kV，電流30 mA，步長0.013°/2θ，掃描速度 2°/min，掃描范圍 4.9°～95°。

根據(jù)式(3)計算纖維素的結(jié)晶度(Esat＆Mustafa，2006):

式中，I002為 002 面衍射強度;I18.0°為衍射角2θ=18.0 °的衍射強度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)的基本處理;采用SPSS軟件包中的方差分析過程(ANOVA)對不同水稻品種各化學組分、紅外光譜吸收峰相對強度、紅外結(jié)晶指數(shù)以及紅外結(jié)晶度進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻秸稈化學成分分析

秸稈化學成分可以說明其營養(yǎng)品質(zhì)，與該水稻品種的營養(yǎng)生理和養(yǎng)分傳輸積累特性，以及特定的栽培管理與生產(chǎn)水平有關(guān)(沈恒勝等，2001b;Ma et al.，2001)。轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8與對照的化學成分見表1。不同部位的化學成分分析結(jié)果表明，秸稈葉片、葉鞘、莖中的粗蛋白含量表現(xiàn)為葉片＞葉鞘＞莖;纖維素含量為莖＞葉鞘＞葉片;半纖維素的含量以莖為最低，葉片與葉鞘含量近似。不同品種同一部位的化學成分分析結(jié)果顯示，在秸稈葉片中，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與對照的纖維素、木質(zhì)素及粗蛋白的含量基本相同，七絲軟粘的半纖維素含量稍低于轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8。在秸稈葉鞘中，七絲軟粘的半纖維素、纖維素含量比轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8稍高，木質(zhì)素及粗蛋白質(zhì)的含量差異不大。在秸稈莖中，半纖維素含量表現(xiàn)為轉(zhuǎn)品1(34.6%)＞轉(zhuǎn)品8(31.4%)＞七絲軟粘(28.2%);纖維素含量則表現(xiàn)為七絲軟粘(33.3%)＞轉(zhuǎn)品8(31.5%)＞轉(zhuǎn)品1(28.8%)。試驗數(shù)據(jù)的差異顯著性分析表明，雖然不同品種間部分化學成分有所差異，但差異未達到顯著水平。

表1 表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈不同組織部位的化學成分分析Table 1 The chemical composition of different parts of transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

2.2 水稻秸稈硅化及其溶解特性分析

沈恒勝等(2001)對稻草硅的吸收、傳遞、在不同組織部位的分布以及可溶性與不可溶硅的存在形式進行研究，發(fā)現(xiàn)品種的嗜硅能力關(guān)系著品種的光系統(tǒng)活性和抗病、抗倒伏特性，同時，硅的溶解比率影響秸稈的化學成分和降解效率。表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8秸稈的總硅含量和硅溶解特性見圖1。分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與對照的總硅含量和硅溶解率接近，且總硅含量表現(xiàn)為葉片、葉鞘＞莖，可溶硅和硅溶解率表現(xiàn)為葉片＞莖、葉鞘。已有研究(胡定金等，1995;Yoshida et al.，1962)顯示，秸稈不同組織部位的總硅含量及硅溶解率的改變可能與水稻成熟時硅的傳輸途徑有關(guān)，為避免過度蒸騰作用，在葉鞘的外表皮層和葉片的上下表皮層形成了大量不可溶硅質(zhì)細胞與葉毛。不同品種同一部位的分析結(jié)果顯示，在葉片中，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與對照的總硅含量基本相同，硅溶解率稍高于七絲軟粘;在葉鞘中，轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的硅溶解率略低于七絲軟粘，總硅含量差異不大;莖中的硅溶解率表現(xiàn)為轉(zhuǎn)品8(56.5%)高于七絲軟粘(51.7%)和轉(zhuǎn)品1(48.9%)。差異顯著性分析結(jié)果顯示，3個供試水稻品種的總硅及硅溶解率不存在顯著差異。

2.3 纖維素的紅外光譜特征

秸稈中纖維素的官能團和化學鍵在紅外光譜中的特定頻率均已明確，因此，通過紅外光譜可以定性和定量分析纖維素中存在的官能團以及它們在轉(zhuǎn)基因水稻及對照中的變化。轉(zhuǎn)基因水稻及對照秸稈纖維素的紅外光譜圖分析表明，3個水稻品種秸稈不同部位纖維素的紅外吸收峰形狀基本相同。

紅外光譜圖中各吸收峰的相對吸收強度見表2。其中，波數(shù)3400 cm－1表征纖維素分子內(nèi)羥基O-H伸縮振動譜帶，波數(shù)2900 cm－1表征纖維素分子間羥基O-H伸縮振動的吸收峰，波數(shù)1637 cm－1表征吸附水的吸收峰，波數(shù)1432 cm－1表征纖維素－CH2彎曲振動和剪切振動的吸收峰。波數(shù)1372 cm－1和1163 cm－1分別表征纖維素和半纖維素中－CH彎曲變型振動和C-OC不對稱伸縮振動的吸收峰，1058～1060 cm－1表征纖維素和半纖維素中C=O伸縮振動的吸收峰，898 cm－1處為β-糖苷鍵振動吸收峰。這些吸收峰強度在轉(zhuǎn)基因水稻及對照間無顯著差異，說明轉(zhuǎn)基因水稻與對照秸稈纖維大分子的結(jié)構(gòu)基本一致。

圖1 表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的總硅含量(A)和硅溶解效率(B)Fig.1 Mean total silicon content(A)and the efficiency of extraction of biogenic silicon(B)of transgenic vs.non-transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

表2 表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈纖維素紅外光譜吸收峰相對強度Table 2 The relative intensity of infrared spectrum absorption peaks of straw cellulose in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

2.4 纖維素的X-射線衍射特征

秸稈中的纖維素是由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)交錯結(jié)合的復雜體系。利用X射線照射樣品，具有結(jié)晶結(jié)構(gòu)的物質(zhì)會發(fā)生衍射并形成一定特性的X-射線衍射圖，由此可用來研究纖維素的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因水稻及對照秸稈不同組織部位纖維素的X-射線衍射圖見圖2。

從圖2中可以看出，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8秸稈的X-射線衍射圖與對照基本一致。在22.0°和18.0°都各有一個主要峰和次要峰，主要峰代表002面峰的強度，即結(jié)晶區(qū)的衍射強度;次要峰代表無定形區(qū)的衍射強度(Masakazu＆Yasuhiko，1996)。由此可知，轉(zhuǎn)基因水稻及對照秸稈不同組織部位的纖維素晶體類型相同，保持著晶區(qū)與非晶區(qū)共存的狀態(tài)。

2.5 纖維素的紅外結(jié)晶指數(shù)與結(jié)晶度分析

纖維素的結(jié)晶度是指纖維素構(gòu)成的結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率，反映了纖維素聚集時形成結(jié)晶的程度，可由紅外光譜圖與X-射線衍射圖計算得出。何艷峰等(2007)采用 O′KI、N·O′KI以及 CrI研究經(jīng)堿處理的秸稈，發(fā)現(xiàn)其纖維素形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由表3可以看出，不同品種的同一組織部位，經(jīng)紅外光譜圖計算得到的 O′KI、N·O′KI，以及經(jīng)X-射線衍射圖計算得出的CrI數(shù)值略有不同，但顯著性分析結(jié)果表明，不同品種間的結(jié)晶指數(shù)和結(jié)晶度不存在顯著差異，這說明轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的纖維素結(jié)晶區(qū)及無定形區(qū)與對照基本一致。

圖2 表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻不同組織部位纖維素的X-射線衍射圖Fig.2 XRD spectra of cellulose in different parts of straw in transgenic(Zhuanpin 1 and 8)rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins vs.non-transgenic equivalent(Quishiruanzhan)

表3 表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈不同組織部位纖維素的紅外結(jié)晶指數(shù)與結(jié)晶度Table 3 The infrared crystalline indices and crystallinity of cellulose in different parts of straw in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

3 討論

國內(nèi)外對水稻秸稈營養(yǎng)品質(zhì)的研究較多，包括對秸稈硅含量的分析(王佳壟等，2008;Wang et al.，2006)，但有關(guān)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻在化學組成方面是否存在差異的研究甚少?；瘜W成分分析是評估轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的非期望效應的基礎，是轉(zhuǎn)基因食品進行安全性評價的重要內(nèi)容(唐茂芝等，2005)。因此，本研究對轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的化學成分和硅化及其溶解特性進行分析，結(jié)果顯示，表達廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8與對照沒有顯著差異。沈恒勝等(2001a)對稻草不同組織部位的纖維組成與硅溶解特性分析后發(fā)現(xiàn)，稻草中纖維素含量表現(xiàn)為莖＞鞘＞葉，總硅和半纖維素的含量以莖為最低，木質(zhì)素含量則以葉為最高。本研究結(jié)果與該結(jié)果基本一致。楊秉耀等(2006)和Belanger et al.(1995)認為，水稻的硅質(zhì)細胞大小和含量與水稻的真菌抗性存在著密切的聯(lián)系。但本文的研究結(jié)果顯示，抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻品種的總硅及硅溶解率與對照不存在顯著差異，說明幾丁質(zhì)酶基因和苜蓿葡聚糖酶基因的導入未引起水稻植株化學成分的明顯變化。

纖維素是構(gòu)成細胞壁的基本物質(zhì)，約占植物干重的50%，在植物體內(nèi)起著重要的支撐作用，為水稻生殖生長奠定基礎(韋存虛等，2008)。但外源基因的導入是否會使水稻秸稈纖維超微結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，目前還未見深入報道。本文采用FTIR和XRD方法研究轉(zhuǎn)基因水稻不同部位的纖維素分子結(jié)構(gòu)及晶體結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果顯示，其與對照并沒有顯著性差異。據(jù)此可以認為，廣譜抗真菌基因的導入不會對秈稻纖維素分子結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。

對轉(zhuǎn)基因作物植株化學成分的差異分析僅是轉(zhuǎn)基因植物安全性評價的一個方面。要想完善轉(zhuǎn)基因水稻的安全性評價體系，還需對其食用安全性以及對生態(tài)環(huán)境的影響進行深入研究。

董金皋，黃梧芳.1995.植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗病性.植物病理學報，25(1):1－3.

國家技術(shù)監(jiān)督局.1994.中華人民共和國國家標準 GB/T 6432－1994飼料中粗蛋白測定方法.http://www.techfood.com/kndata/1029/0059792.htm.

何艷峰，李秀金，方文杰，康佳麗.2007.NaOH固態(tài)預處理對稻草中纖維素結(jié)構(gòu)特性的影響.可再生能源，25(5):31－34.

胡定金，謝振翅，王富華.1995.水稻硅、鋅、錳配施效應.植物營養(yǎng)與肥料學報，(Z1):3－4，81－88.

彭維，向志明.2007.水稻秸稈的纖維素酶水解研究.四川食品與發(fā)酵，43(3):11－15.

沈恒勝，陳君琛，倪德斌.2001a.稻草硅化和溶解特性對稻草纖維降解率及其利用的影響.中國農(nóng)業(yè)科學，34(6):672－678.

沈恒勝，陳君琛，謝華安.2001b.汕優(yōu)63稻草營養(yǎng)品質(zhì)與品種特性的關(guān)系.福建農(nóng)業(yè)學報，16(2):1－5.

唐茂芝，黃昆侖，唐小革，周可，羅云波.2005.外源蛋白基因?qū)γ拮褷I養(yǎng)成分影響的研究.食品科學，26(11):55－58.

王關(guān)林，方宏筠.2009.植物基因工程.北京:科學出版社.

王佳壟，葉丹妮，李文婷，劉建新.2008.化學預處理對稻草硅化程度的影響及其對瘤胃降解率的改善效果.動物營養(yǎng)學報，20(2):170－175.

韋存虛，謝佩松，周衛(wèi)東，陳義芳，嚴長杰.2008.水稻脆性突變體葉的解剖結(jié)構(gòu)和化學特性.作物學報，34(8):1417－1423.

楊秉耀，陳新芳，劉向東，郭海斌.2006.水稻不同品種葉表面硅質(zhì)細胞的掃描電鏡觀察.電子顯微學報，25(2):146－149.

葉君，熊犍.1999.超聲波處理引起紙漿纖維素結(jié)晶度變化.廣東造紙，(2):6－10.

張志忠，吳菁華，呂柳新，林義章.2005.植物幾丁質(zhì)酶及其應用研究進展.福建農(nóng)林大學學報:自然科學版，34(4):494－499.

Belanger R R，Bowen P A，Ehret D L and Menzies J G.1995.Soluble silicon its role in crop and disease management of greenhouse crops.Plant Disease，79:329 －335.

Esat G and Mustafa U.2006.Dependence of chemical and crystailine structure of alkali sulfite pulp on cooking temperature and time.Carbohydrate Polymers，65:461 －468.

Ma J F，Miyake Y and Takahashi E.2001.Silicon as a beneficial element for crop plants∥Datnoff L E，Snyder G H and Korndorfer G H.Silicon in Agriculture.New York:Elsevier Science，17 －39.

Masakazu G and Yasuhiko Y.1996.Ammoniation of barley straw:effect on cellulose crystallinity and water-holding capacity.Animal Feed Science Technology，58:239 －247.

Soest P J and Robertson J B.1985.Analysis of Forages and Fibrous Food—A Laboratory Manual for Animal Science 613.New York:Cornell University Press.

Soest P J，Robertson J B and Lewis B A.1991.Method for dietary fiber，neutral detergent fiber，and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition.Journal of Dairy Sciences，74:3583 －3597.

Wang H F，Wu Y M，Liu J X and Qian Q.2006.Morphological fractions，chemical compositions and in vitro gas production of rice straw from wild and brittle culm1 variety harvested at different growth stages.Animal Feed Science and Technology，129:159 －171.

Yoshida S，Ohnishi Y and Kjtagishi K.1962.Histochemistry of the rice plant.II.Localisation of silicon within the rice tissues.Soil Science and Plant Nutrition，8:36 －41.