青春雙歧菌耐氧馴化及培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

張 智，黃 放，王 闖，王振宇，2，*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001)

青春雙歧菌耐氧馴化及培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

張 智1，黃 放1，王 闖1，王振宇1，2，*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001)

對一株青春雙歧桿菌進行耐氧馴化，通過有氧、無氧交替馴化法對出發(fā)菌株進行耐氧馴化，得到耐氧能力較強的青春雙歧桿菌菌株，在有氧靜止培養(yǎng)條件下活菌數(shù)可達到4.31×1011cfu/mL。對該耐氧菌株通過響應(yīng)面法進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，確定培養(yǎng)耐氧青春雙歧桿菌的最佳條件:接種量5%，玉米糖化液濃度12.1°Bx，初始pH6.48，培養(yǎng)溫度37℃，發(fā)酵時間24h。在此條件下菌液最大OD值為1.819，此條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)為3.05×1012cfu/mL。

青春雙歧桿菌，耐氧馴化，響應(yīng)面法

雙歧桿菌是健康個體腸道中的優(yōu)勢菌，高密度的雙歧桿菌菌群對維持宿主健康有著舉足輕重的意義［1－2］，它與人的一生始終保持著和諧的共生關(guān)系，其促進人體健康的有益作用遠遠超過其它乳酸菌。它是人體腸道內(nèi)100多種細(xì)菌中典型的對人體有益無害細(xì)菌［3］，有抑制致病菌和腐敗菌、提供營養(yǎng)、提高免疫力、抗腫瘤等功能［4－7］。為解除厭氧培養(yǎng)雙歧桿菌對工業(yè)化生產(chǎn)要求的制約，降低生產(chǎn)成本，亟需對青春雙歧桿菌進行耐氧培養(yǎng)馴化，以及應(yīng)用廉價并具有豐富營養(yǎng)價值的玉米為原料對其進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，進而對工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青春雙歧桿菌菌株 本實驗室保藏;活化培養(yǎng)基 鮮牛奶(市售);篩選培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基;優(yōu)化培養(yǎng)基 自制玉米汁培養(yǎng)基。

YQX－厭氧培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DHG－9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;722S型可見分光光度計 上海精密儀器科技有限公司;電腦程控壓力蒸汽滅菌鍋

長春百奧生物儀器有限公司;SW－CJ－IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ALC－210.2電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋、TDA－8002恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;85－2電磁攪拌器 哈爾濱科器醫(yī)療設(shè)備有限公司;雙目顯微鏡。

1.2 出發(fā)菌株選擇

采用平板稀釋分離法，將菌種的發(fā)酵液在合適的稀釋度下稀釋后涂布于分離平板，37℃厭氧培養(yǎng)48h(置于厭氧培養(yǎng)箱中，使用前用氮氣換氣兩次，并充入氫氣和二氧化碳混合氣體造成厭氧環(huán)境)，觀察菌落形態(tài)特征并挑取大的完整的菌落，進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，對可疑為雙歧桿菌的菌落，在厭氧條件下接種培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h。然后在厭氧條件下繼續(xù)分離、純化，直至獲得純培養(yǎng)。

1.3 耐氧菌株篩選

先將純化好的幾株菌在厭氧條件下培養(yǎng)，然后在好氧條件下培養(yǎng)，24h傳一代，不斷增加好氧培養(yǎng)的時間，縮短厭氧培養(yǎng)的時間。并且在改變培養(yǎng)環(huán)境的同時，在裝液量(30mL)一定的條件下，逐漸增加培養(yǎng)器皿的容積，也就是增加培養(yǎng)基中菌與氧氣的接觸面積即由試管培養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)換為三角瓶培養(yǎng)，讓其逐漸適應(yīng)有氧環(huán)境。

1.4 耐氧菌株生長曲線的測定

以2h為間隔，取樣稀釋25倍，以蒸餾水為對照，在波長600nm測其OD值，根據(jù)OD值和時間分別作厭氧菌株和耐氧菌株的菌體生長曲線。

1.5 耐氧菌株最適生長條件實驗

1.5.1 玉米糖化液濃度單因素 玉米粉糖化5h后，離心并過濾至澄清，分別以濃度為8、9、10、11、12、13、14、15°Bx做培養(yǎng)基，接種量為5%，初始pH為自然pH，37℃有氧培養(yǎng)至生長對數(shù)期，對其吸光度進行檢測。

1.5.2 接種量單因素 在上述單因素最好水平基礎(chǔ)上，分別接入1%、3%、5%、7%、9%、11%的菌種，自然pH，37℃有氧培養(yǎng)至生長對數(shù)期，對其吸光度進行檢測。

1.5.3 培養(yǎng)初始pH單因素 在上述單因素最好水平基礎(chǔ)上，初始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0培養(yǎng)菌種，37℃培養(yǎng)至生長對數(shù)期，對其吸光度進行檢測。

1.5.4 培養(yǎng)溫度單因素 在上述單因素最好水平基礎(chǔ)上，分別在溫度為28、31、34、37、40、43、46℃下進行培養(yǎng)至生長對數(shù)期，對其吸光度進行檢測。

1.5.5 促生長因子單因素 在上述單因素最好水平基礎(chǔ)上，分別添加促生長因子，葡萄糖0.5%、低聚果糖0.5%、低聚木糖0.5%，酵母膏0.5%，大豆蛋白胨0.5%培養(yǎng)至生長對數(shù)期對其吸光度進行檢測。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上綜合考慮選取主要的三個因素:玉米糖化液濃度、初始pH、溫度為自變量利用響應(yīng)面分析法(RSM)對其進行定量、定性分析。每個因素取三水平，以(－1，0，1)編碼，以吸光度為響應(yīng)值，進行實驗設(shè)計。如表 1所示，采用MINITAB15軟件進行數(shù)據(jù)處理。

表1 因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的活化選擇

將實驗室保存的菌種接種到牛奶培養(yǎng)基中，厭氧條件37℃下培養(yǎng)24h，選取10－8、10－9、10－10三個稀釋度涂平板，厭氧條件37℃下培養(yǎng)24～48h，在MRS瓊脂平板上長出菌落。

觀察菌落特征，乳白色小菌落，圓形隆起，直徑大約1～2mm，表面粘稠較光滑，邊緣整齊，具有柔軟質(zhì)地，易挑取。挑取具有如上特征的菌落進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，革蘭氏呈陽性，菌體為桿狀，長短不一，多數(shù)呈彎曲狀或V字形，不能游動，無芽孢和鞭毛，此為典型雙歧桿菌特征。

再挑取菌落并接種到牛奶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用上述的方法涂平板觀察菌落特征，挑取較大的菌落保存，作為有氧馴化的出發(fā)菌株，將菌株接種到牛奶培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其凝固后將試管口密封，放入0～4℃冰箱中保存。

2.2 耐氧菌株的篩選

2.2.1 交替馴化法 a.試管培養(yǎng)

b.三角瓶培養(yǎng)

2.2.2 耐氧能力測試 將青春雙歧桿菌在厭氧和有氧條件下分別進行液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)，得出結(jié)果如表2和表3所示。青春雙歧桿菌經(jīng)牛奶液體培養(yǎng)，在厭氧條件下菌體為桿狀，長短不一，多數(shù)呈彎曲狀或V字型，為典型雙歧桿菌特征，經(jīng)有氧條件下培養(yǎng)后，其特征無明顯變化，但菌體略有變細(xì)和著色不均勻現(xiàn)象。青春雙歧桿菌經(jīng)MRS固體培養(yǎng)后，在厭氧和有氧條件下的菌落形態(tài)沒有變化，但厭氧條件下的菌落直徑要比有氧條件下的菌落大一些，并且長出菌落的時間要短的多。

有氧條件下青春雙歧活菌計數(shù)是 4.31×1011cfu/mL，厭氧條件下活菌數(shù)是5.12×1012cfu/mL，說明此菌已具有較好的耐氧能力，可以在三角瓶中靜止?fàn)顟B(tài)下培養(yǎng)，但菌體生長狀態(tài)不如厭氧條件下旺盛，菌體體積較厭氧培養(yǎng)的菌體小。

通過平板培養(yǎng)的結(jié)果表明:在厭氧條件下，24h內(nèi)就能長出菌落，而在有氧條件下則需要40～48h，這說明固體培養(yǎng)對氧的敏感性要強于液體培養(yǎng)。并且，固體培養(yǎng)是厭氧條件比有氧條件菌落直徑大，說明厭氧培養(yǎng)效果總體優(yōu)于有氧培養(yǎng)，但此菌已具有一定的耐氧能力。

2.3 菌株生長曲線

用于發(fā)酵的菌體要求生長旺盛、強壯，因而要選用最佳菌種生長期——對數(shù)生長期的菌體。如圖1所示，無氧條件下青春雙歧桿菌培養(yǎng)18h時OD值最高，有氧條件下青春雙歧桿菌培養(yǎng)20h時OD值最高。則以后的實驗無氧條件培養(yǎng)時18h為培養(yǎng)終止時間，并選用此時的菌株作為檢測樣品，有氧條件培養(yǎng)時20h為培養(yǎng)終止時間，并選用此時的菌株作為檢測樣品。

表2 液體培養(yǎng)青春雙歧桿菌的特征

表3 固體培養(yǎng)青春雙歧桿菌的特征

圖1 青春雙歧桿菌在有氧和無氧條件下的生長曲線圖

2.4 耐氧菌株最適生長條件

2.4.1 玉米糖化液濃度對菌體生長的影響 實驗結(jié)果表明，玉米糖化液濃度對菌體生長有較大影響，如圖2所示，其OD值在12°Bx時達到最高，此時菌液濃度最大;當(dāng)糖化液濃度再增大時，由于外界溶液濃度過高，會對細(xì)胞產(chǎn)生滲析作用從而影響菌體的生長，使菌液濃度降低。因此，選擇12°Bx作為今后實驗的玉米糖化液濃度。

圖2 玉米糖化液濃度對菌體生長的影響曲線圖

圖3 接種量對菌體生長的影響曲線圖

2.4.2 接種量對菌體生長的影響 以上實驗結(jié)果表明，隨著接種量的增加，菌液OD值逐漸增大，即菌液濃度逐漸增加，如圖3所示，因此可以得出，采用較大的接種量可以促進總菌數(shù)在接種后較短時間內(nèi)恢復(fù)增長，縮短總菌數(shù)達到最高峰的時間，但過大的接種量會增加成本，且有可能帶入較多的代謝產(chǎn)物，造成最終產(chǎn)物提取困難，由以上數(shù)據(jù)確定本實驗接種量為5%。

2.4.3 初始pH對菌體生長的影響 實驗結(jié)果表明，菌體的生長狀況與初始pH大小關(guān)系較密切。如圖4所示，pH偏小或偏大都會影響菌體的生長，綜合考慮選用pH6.5為發(fā)酵初始值，此時的菌液OD值達到最高，即菌液濃度最大。

圖4 初始pH對菌體生長的影響曲線圖

2.4.4 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響 如圖5所示，結(jié)果表明，在37℃時菌液OD值達最大，即37℃是菌體最適宜生長溫度，在此條件下菌液能夠達到濃度最大。當(dāng)溫度再增大時影響菌體的正常代謝，OD值逐漸下降，所以本實驗選取37℃為培養(yǎng)溫度。

圖5 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響曲線圖

2.5 響應(yīng)面實驗

2.5.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計 采用MINITAB軟件Box－Behnken設(shè)計來模擬響應(yīng)面模型，設(shè)計3因素3水平實驗，共15個實驗點，其中，13個析因?qū)嶒烖c，3個中心點實驗，中心點重復(fù)實驗用來估計實驗誤差。以3次平行實驗菌液吸光度平均OD值作響應(yīng)值，做響應(yīng)面實驗。各個因素和水平見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

由于各因素對青春雙歧桿菌生長的影響不是簡單的線性關(guān)系，為了更明確各因子對其的影響，采用MINTAB軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型:

Y=1.77+0.0260A－0.00050B－0.00250C－0.110A2－0.103B2－0.0950C2－0.0530A×B+0.0070A×C+0.0480B×C

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.5.2 回歸分析 表5反映了回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果，糖化液濃度的二次項，初始pH的二次項以及培養(yǎng)溫度的二次項對菌體生長的影響效果在0.001水平達到極顯著，糖化液濃度與初始pH的交互項在0.01水平達到顯著，糖化液濃度的一次項以及初始pH與培養(yǎng)溫度的交互項對菌體生長的影響效果在0.1水平達到顯著，其余因素影響不顯著。注:“*”在0.1水平顯著;“**”在0.01水平顯著;“***”在0.001水平顯著;表6同。

表5 回歸系數(shù)顯著性分析

其決定系數(shù)R2=0.9774說明實驗值與預(yù)測值非常接近。如表6可知，二次回歸模型極顯著(P=0.001)，失擬相不顯著(P=0.203)，則說明該模型與實驗擬合良好，可以用于青春雙歧桿菌發(fā)酵分析和預(yù)測。方差分析表明，以上回歸方程較好地擬合了實驗數(shù)據(jù)(見表5、表6)。

表6 回歸方程檢驗結(jié)果

2.5.3 各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖 為了使各因素及其交互影響能有效地直觀反映，利用MINITAB15軟件程序作出響應(yīng)曲面圖，見圖6～圖8，從三幅圖可以直觀地看出，三因素交互作用有其最大值。響應(yīng)曲面的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強弱大小，曲面壁平緩表示兩交互作用不顯著，曲面壁陡峭表示兩交互作用顯著。

圖6結(jié)果顯示了培養(yǎng)溫度取中心水平時，糖化液濃度和初始pH對菌體生長影響的交互作用。從響應(yīng)曲面壁較陡峭可知交互作用較顯著，糖化液濃度因素影響較顯著，在實驗水平范圍內(nèi)隨著糖化液濃度的增加，菌液濃度呈先增加后減小的趨勢，在糖化液濃度較低時，初始pH對菌體生長的影響顯著，表現(xiàn)為先增加后減小的過程，在糖化液濃度取高水平時初始pH對菌體生長影響不大。從圖6可以看出，糖化液濃度為11.8～12.5°Bx，初始pH為6.25～7.10時，菌液OD值可達實驗的最大值。

圖6 菌液吸光度與糖化液濃度、初始pH的響應(yīng)曲面圖

圖7結(jié)果顯示了初始pH取中心水平時，糖化液濃度和培養(yǎng)溫度對菌體生長影響的交互作用。從響應(yīng)曲面壁較平緩可知，交互作用不顯著，糖化液濃度因素影響顯著，在實驗水平范圍內(nèi)隨著糖化液濃度的增加菌液濃度呈先增加后減小的趨勢，在糖化液濃度較低時，培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響顯著，表現(xiàn)為先增加后減小的過程，在糖化液濃度取高水平時，培養(yǎng)溫度對菌體生長影響不大。從圖7可以看出，糖化液濃度為 11.8～12.6°Bx，培養(yǎng)溫度為35.5～38.5℃時，菌液OD值可達實驗的最大值。

圖7 菌液吸光度與糖化液濃度、培養(yǎng)溫度的響應(yīng)曲面圖

圖8結(jié)果顯示了糖化液濃度取中心水平時，初始pH和培養(yǎng)溫度對菌體生長影響的交互作用。從響應(yīng)曲面壁較陡峭可知交互作用較顯著。在初始pH較低和較高時，培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響顯著，在初始pH取中心水平時培養(yǎng)溫度對菌體生長影響不大;在培養(yǎng)溫度較低和較高時，初始pH對菌體生長的影響顯著，在培養(yǎng)溫度取中心水平時，初始pH對菌體生長影響不大。從圖8可以看出，初始pH為6.25～7.00，培養(yǎng)溫度為35.5～38.5℃時，菌液OD值可達實驗的最大值。

圖8 菌液吸光度與初始pH、培養(yǎng)溫度的響應(yīng)曲面圖

2.5.4 培養(yǎng)條件最適組合 在獲得非線性回歸模型和響應(yīng)面之后，為了求得最佳發(fā)酵條件，通過SAS軟件對數(shù)據(jù)及方程進行分析，可以得到最大活菌數(shù)時的最佳條件，即:A=0.1271、B=－0.0395、C=－0.0184，即玉米糖化液濃度為12.1271°Bx、初始pH為6.4903、培養(yǎng)溫度為36.9448℃，在此條件下培養(yǎng)菌液的響應(yīng)面理論預(yù)測OD值可達1.852。

2.5.5 驗證實驗 為驗證響應(yīng)面法的可靠性，對該優(yōu)化條件進行驗證實驗，重復(fù)三次。綜合上述最優(yōu)化條件和實際可操作性，按以下條件做驗證性實驗:玉米糖化液濃度為12.1°Bx，初始pH為6.48，培養(yǎng)溫度為36.9℃。實際菌液OD值為1.819，實際值比預(yù)測值誤差－1.81%，可見該模型能夠較好地預(yù)測實驗結(jié)果，可以為青春雙歧桿菌培養(yǎng)在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。通過顯微鏡觀察及平板計數(shù)法觀察，在此最佳條件下的菌株培養(yǎng)20h后活菌數(shù)達到3.05×1012cfu/mL。

3 討論

本實驗經(jīng)交替法馴化后，篩選出耐氧青春雙歧桿菌菌株，可以在有氧條件靜止?fàn)顟B(tài)下培養(yǎng)，8h凝乳，培養(yǎng)24h，活菌數(shù)達到4.31×1011cfu/mL，厭氧培養(yǎng)效果總體優(yōu)于有氧培養(yǎng)，但其具有較好的耐氧能力。

本研究經(jīng)過對玉米糖化液濃度、接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度、促生長因子等相關(guān)因素的單因素實驗和響應(yīng)面綜合實驗，確定培養(yǎng)耐氧青春雙歧桿菌的最佳條件:接種量5%，玉米糖化液濃度12.1°Bx，初始pH6.48，培養(yǎng)溫度37℃，發(fā)酵時間20h。在此條件下菌液最大OD值為1.819，此條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)為3.05×1012cfu/mL。

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Domesticating oxytolerant Bifidobacterium adolescentis and optimizing condition of culture by response surface methodology

ZHANG Zhi1，HUANG Fang1，WANG Chuang1，WANG Zhen－yu1，2，*
(1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150001，China)

The Bifidobacterium adolescentis had been domesticated aerotolerant by cultivating with and without oxygen alternately.After being domesticated，it became so strong that it can multiply 4.31×1011cfu/mL with oxygen.The condition of culture was optimized through response surface method and the optimum culture conditions were obtained:5%of the Bifidobacterium adolescentis，12.1°Bx of the corn juice concentration，pH 6.48，fermentation temperature of 37℃，fermentation time of 24h，OD can get 1.819 and viable count was 3.05×1012cfu/mL.

Bifidobacterium adolescentis;oxygen－resistant domesticated;response surface methodology

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0208－05

2010－03－10 *通訊聯(lián)系人

張智(1964－)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化。