一株黃曲霉拮抗細菌的分離篩選及鑒定

涂彩虹，秦 文，胡欣潔，李素清

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014)

一株黃曲霉拮抗細菌的分離篩選及鑒定

涂彩虹，秦 文*，胡欣潔，李素清

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014)

通過稀釋分離法從土壤中分離純化出一株具有黃曲霉拮抗活性的菌株。該菌株的次生代謝產(chǎn)物具有抑制黃曲霉生長的效果，抑菌率可達63%。該菌對多種病原真菌抑制效果明顯，具有廣譜抑菌效果。根據(jù)形態(tài)學觀察、生理生化反應和16S rDNA鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌。

黃曲霉，拮抗菌，分離鑒定，枯草芽孢桿菌

霉菌毒素污染造成全世界每年糧食的損失達數(shù)千億美元［1－2］，而黃曲霉毒素因其對人、畜肝臟的劇烈損害而名列毒性之首，被列為極毒。黃曲霉毒素(AFT)主要是糧油食品上常出現(xiàn)的黃曲霉(Aspergillu flavas Link)和寄生曲 霉 (AspergillusParasiticas Speave)產(chǎn)生的一種具活性的、有毒的次級代謝產(chǎn)物。黃曲霉可通過產(chǎn)生孢子進行傳播，侵染植物、植物產(chǎn)品、各種食品和飼料等［3］。它對農(nóng)作物的產(chǎn)量，人、獸和禽類的健康構成很大威脅［4］。凡是含淀粉多的食品，如玉米、花生、大豆、大米、小麥、面粉等最易受到黃曲霉及其毒素的污染，果仁類也常受污染。對黃曲霉及其毒素的生物防治，目前國內外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代謝產(chǎn)物來獲得具有抗菌或降解毒素特性的物質。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物提取物，如山蒼子精油［5］、百里香油［6］、海馬齒香精油［7］、玫瑰精油［8］等對黃曲霉生長以及毒素的產(chǎn)生有較強抑制作用。目前發(fā)現(xiàn)能有效防治黃曲霉的微生物主要有乳酸菌、芽孢桿菌以及不產(chǎn)毒黃曲霉和黑曲霉等。GOURAMA和BULLERMAN［9］研究表明，市售的青貯飼料接種植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌(L.plantaru，L.Delbrueckii subsp.bulgaricus＆L.acidophilus)的混合菌種，具有對黃曲霉的抗菌和抗毒素的活性。曹冬梅等［10］對1株具霉菌抑制活性的彎曲乳酸桿菌與黃曲霉共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌絲產(chǎn)量和AFTB1產(chǎn)量均比黃曲霉單獨培養(yǎng)時低。枯草芽孢桿菌可減少68%的黃曲霉生長和58%AFTB1的產(chǎn)生［11］。KONG等［12］將篩選出的一株海生巨大芽孢桿菌液體培養(yǎng)產(chǎn)物應用在花生上，能減少黃曲霉在花生上的發(fā)病率，且在實驗設定范圍內隨著細菌濃度增大和培養(yǎng)時間的加長，抑菌效果明顯增強。本研究以土壤為材料，通過稀釋分離法，分離、篩選和純化出具有黃曲霉拮抗活性的菌株，為進一步研究其抑菌機理和生物防治技術提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 采自四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場小麥田中的土壤;黃曲霉B3.4408(Aspergillus flavus) 由西南大學食品微生物實驗室提供;供試病原菌 禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、玉 米 大 斑 病 菌 (Exserohilum turcicum)、西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxyporum f sp.niveum)、馬鈴薯早疫病菌(Alternaria solani)、萵苣灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers)，均由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供;桃褐腐病菌(Monilinia fructicola) 由中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院提供;尖孢炭疽菌(Colletorichum acutatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria parva)、大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 均由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工四川省級重點實驗室保存;營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯 購于北京奧博星生物技術有限責任公司;PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L、蒸餾水1000mL;細菌微量生化反應管 購于杭州微生物試劑有限公司;16S rDNA的PCR擴增引物、TIANamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒 購于天根生化科技公司。

SW－CJ－1F潔凈工作臺，YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，DG－410型電熱恒溫培養(yǎng)箱，HZQ－X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，精密電子天平，UNIC7200型分光光度計，BR4i型高速冷凍離心機，游標卡尺，冰箱，PHS－3C型數(shù)顯酸度計，水平電泳裝置，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 菌株活化

指示菌黃曲霉B 3.4408、禾谷鐮刀菌、玉米大斑病菌、西瓜枯萎病菌、馬鈴薯早疫病菌、萵苣灰霉病菌、桃褐腐病菌、尖孢炭疽菌、葡萄座腔菌均采用PDA試管斜面劃線，于28℃培養(yǎng)7d后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃曲霉孢子懸液制備

將黃曲霉菌株接種在PDA斜面，28℃培養(yǎng)7d后，挑取斜面上的孢子于一定量含0.05%(v/v)吐溫－80的無菌蒸餾水中，混勻。將孢子濃度調整為1×105cfu/mL，待用。

1.4 菌株篩選

1.4.1 拮抗細菌的初篩 以營養(yǎng)瓊脂為分離培養(yǎng)基，用常規(guī)稀釋平板分離法分離土壤樣品中的細菌菌株。菌株的初篩采用對峙培養(yǎng)法，即挑取黃曲霉孢子接種于PDA平板中央，在離中心約2cm處接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不同的單菌落進行抑菌實驗［4］，30℃ 培養(yǎng)5d，挑取有抑菌帶的細菌劃線純化，將最終有抑菌效果的拮抗菌保存于營養(yǎng)瓊脂斜面，置4℃冰箱備用。

1.4.2 拮抗細菌的復篩 將初篩的細菌接種于PD培養(yǎng)基中，37℃，120r/min恒溫搖床培養(yǎng)3d，培養(yǎng)液于8000r/min離心20min，取其上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾去除菌體。取1mL無菌上清液于平板中，傾注入20mL PDA培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑6mm打孔器在平板中央打孔，向孔中注入10μL濃度為1×105cfu/mL的黃曲霉孢子懸液，無菌水作為對照。30℃，靜置培養(yǎng)90h后測量黃曲霉直徑，以抑菌率表示細菌的拮抗效果［12］。每處理3次重復，抑菌率按照以下公式計算:

1.5 黃曲霉拮抗細菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)學特征 在營養(yǎng)瓊脂平板37℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)特征。同時取樣進行革蘭氏染色后于高倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5.2 生理生化特征 進行接觸酶、氧化酶反應、糖醇類發(fā)酵實驗、硝酸鹽實驗、淀粉水解、明膠水解、V－P反應、苯丙氨基酸脫氨酶、吲哚實驗、檸檬酸鹽的利用、耐鹽性實驗等［13－14］。

1.5.3 16S rDNA鑒定 采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA。采用細菌通用引物:正向引物27f:5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′;反向引物1492r:5′－CGGTTACCT TGTTACGACTT－3′。以黃曲霉拮抗菌株基因組DNA作為PCR擴增的模板，終濃度為1μL/25μL反應體系。PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性45s，56℃ 退火45s，72℃ 延伸90s，循環(huán)30次;72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳分析并送大連寶生物工程有限公司純化測序。測序得到的序列提交到NCBI進行BLAST，進行序列同源性分析。

1.6 菌株生長曲線測定

將拮抗細菌種子液按2%接種量接于PD培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃，120r/min振蕩培養(yǎng)，取不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)物采用比濁法于波長600nm處測定細菌細胞生長量的吸光度值。測定時間:前24h，每2h測一次;24～60h，每4h測一次;60～100h，每4h測一次。以培養(yǎng)時間為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.7 抗菌譜的測定

對桃褐腐病菌、西瓜枯萎病菌、土豆早疫病菌、玉米大斑病菌、萵苣灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、葡萄座腔菌、尖孢炭疽菌等病原真菌采用平板對峙法;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌采用牛津杯法測定拮抗細菌抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 拮抗細菌的初篩 從土壤中分離到1株抑菌效果明顯的拮抗菌，在30℃下，PDA培養(yǎng)基中與黃曲霉對峙培養(yǎng)5d后，測得待測菌對黃曲霉拮抗帶寬度為6.98mm。

2.1.2 拮抗細菌的復篩 細菌培養(yǎng)液經(jīng)離心過濾，將菌體去除干凈后，進行抑菌實驗分析。拮抗細菌培養(yǎng)上清液對黃曲霉生長具有明顯抑制作用，抑菌率達到63%(見圖1)。因此，可以說明實驗所篩選的細菌能產(chǎn)生具有抑制黃曲霉生長的物質。

圖1 拮抗菌復篩結果(A.實驗組;B.對照組)

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征 待測菌菌落在營養(yǎng)瓊脂上呈圓形，凸起，表面褶皺，邊緣波紋狀，灰白色，表面無光澤，不透明，直徑3～4mm(37℃，24h)，粘稠。在液體培養(yǎng)基表面形成菌膜。用光學顯微鏡10×100倍下觀察，菌體呈桿狀，大小均勻，芽孢中生，橢圓，不膨大，見圖2。

圖2 拮抗菌形態(tài)

2.2.2 生理生化特征 拮抗菌的生理生化鑒定結果見表 1。以枯草芽孢桿菌為對照菌，參考文獻［13－14］中的枯草芽孢桿菌生化反應特征，初步確定其為枯草芽孢桿菌。

表1 拮抗菌的生理生化特性

2.2.3 16S rDNA鑒定 以通用引物進行PCR擴增，獲得了1條特異的、大小約為1.5kb的擴增條帶。獲得的特異片段經(jīng)純化和測序后，通過 Blast程序與GenBank核酸序列庫中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)待測菌與枯草芽孢桿菌的相似性超過99%。結合生理生化的鑒定結果，拮抗菌鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

2.3 菌株生長曲線測定

枯草芽孢桿菌在PD液體培養(yǎng)基中生長曲線如圖2?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)0～10h時生長速率緩慢，菌體幾乎不增加，為遲緩期;10h后生長速率加快，進入對數(shù)生長期，在20～90h菌體量隨時間延長基本保持平衡，處于穩(wěn)定期;90h后進入生長衰亡期，此時，菌體呈現(xiàn)負增長，菌體數(shù)量開始急劇下降。

圖3 枯草芽孢桿菌生長曲線

2.4 抗菌譜的測定

枯草芽孢桿菌與植物病原菌對峙培養(yǎng)結果如表2所示。在與供試病原菌對峙培養(yǎng)中，對病原真菌桃褐腐病菌、西瓜枯萎病菌、土豆早疫病菌、玉米大斑病菌、萵苣灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、葡萄座腔菌和尖孢炭疽菌都有明顯的效果;而對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌則無抑菌作用，說明該枯草芽孢桿菌對多種真菌生長抑制效果較好。

表2 拮抗菌的抑菌譜

3 結論

從土壤中篩選出的這株細菌及其代謝產(chǎn)物均能高效地抑制黃曲霉的生長。同時該菌對多種病原真菌抑制效果明顯，具有廣譜抑菌效果。根據(jù)形態(tài)學觀察、生理生化反應和16S rDNA鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌，該菌可進一步作為黃曲霉生物防治的研究對象。

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Isolation and identification of
an antagonistic bacteria of Aspergillus flavus

TU Cai－h(huán)ong，QIN Wen*，HU Xin－jie，LI Su－qing
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

Four bacteria which had obvious antagonistic effect on Aspergillus flavus were screened from soil.The secondary metabolite of bacterium could inhibit the growth of Aspergillus flavus effectively and the rate of inhibitory was 63%.It had fungi stasis on many different kinds of pathogenic fungi and had broad－spectrum antibacterial activity also.With regard to morphological features，physiological and biochemical test，and 16S rDNA sequences analysis，the strain was identified.The results showed that the strain belonged to Bacillus subtilis.

Aspergillus flavus;antagonistic bacteria;separation and identification;Bacillus subtilis

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0182－04

2010－12－28 *通訊聯(lián)系人

涂彩虹(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:食品微生物與發(fā)酵工程。

食品加工四川省高校重點實驗室開放基金資助。