低溫果膠酶的純化及酶的化及酶學(xué)性質(zhì)的研究

王 偉，李 鋒，張 磊，茆 軍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830052;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處，新疆烏魯木齊830052;4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，新疆烏魯木齊830091)

低溫果膠酶的純化及酶的化及酶學(xué)性質(zhì)的研究

王 偉1，李 鋒2，張 磊3，茆 軍4

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830052;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處，新疆烏魯木齊830052;4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，新疆烏魯木齊830091)

進(jìn)行了低溫果膠酶產(chǎn)生菌的篩選，并對(duì)低溫果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)、純化及動(dòng)力學(xué)常數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:該酶最適酶反應(yīng)溫度25℃，最適酶反應(yīng)pH為5.8;酶液的pH穩(wěn)定范圍在5～6.4;在25℃保溫3h，酶活降至50.5%，在35℃保溫2h，酶活降至55.1%，在45℃保溫1.5h，酶活降至48.7%，在55℃保溫1h，酶活降至43.1%;金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+對(duì)低溫果膠酶有激活作用，而B(niǎo)a2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+對(duì)低溫果膠酶有強(qiáng)烈的抑制作用;當(dāng)以果膠為底物時(shí)，該酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為27.86mg/mL，Vmax為152.13μmol/(min·mL);采用不同的處理方法均可使低溫果膠酶得到純化，但40%～85%的硫酸銨分級(jí)沉淀純化效果最好。

低溫果膠酶，最適酶反應(yīng)溫度，最適酶反應(yīng)pH，分離純化

果膠，化學(xué)名聚半乳糖醛酸，主要是由D－半乳糖醛酸以α－1，4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物，是植物體中一類復(fù)雜的膠體性多糖類，是植物細(xì)胞壁的組成成分，填充在植物的細(xì)胞壁之間，具有使細(xì)胞粘合在一起的作用［1］。果膠經(jīng)果膠酶分解后，植物細(xì)胞便分離。果膠酶是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，果膠酶可分為兩大類:解聚酶和果膠酯酶［2－4］。果膠酶主要運(yùn)用于果汁提取、果汁澄清、果酒澄清與過(guò)濾、果實(shí)脫皮、紡織工業(yè)麻類脫膠、畜牧業(yè)的飼料添加劑及中藥營(yíng)養(yǎng)液的深加工等。面對(duì)當(dāng)今世界社會(huì)發(fā)展的重大問(wèn)題(如糧食短缺、資源枯竭、生態(tài)環(huán)境惡化)，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了低溫果膠酶的研究，旨在利于節(jié)約能源，保護(hù)環(huán)境，并在降低生產(chǎn)成本等方面發(fā)揮積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 由實(shí)驗(yàn)室從采集的土樣中分離得到;富集培養(yǎng)基 牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，橘皮粉2%，pH7;初篩平板培養(yǎng)基果膠0.1%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，瓊脂2%，pH7;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 橘皮粉2%，硫酸銨0.2%，酵母膏0.5%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%，NaCl0.1%，MnSO40.00025%，F(xiàn)eSO40.00075%，pH7;種子培養(yǎng)基 麥芽膏0.3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，葡萄糖1.0%，pH6.5。

541 7R型高速冷凍離心機(jī)，F(xiàn)A2104型電子天平，LDZX－40BI型高壓滅菌鍋，GKC型數(shù)顯控溫水浴鍋，THZ－82恒溫振蕩器，SW－CJ－IC型超凈工作臺(tái)，DHG－9140A型恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 技術(shù)路線 采樣→富集培養(yǎng)→初篩→復(fù)篩→酶學(xué)特性研究

1.2.1.1 初篩 將富集培養(yǎng)液稀釋涂布于初篩平板上，25℃培養(yǎng)6d左右，加1%(W/V)的十六烷基三甲基溴化銨，靜置，菌落周圍出現(xiàn)透明圈的為產(chǎn)果膠酶的菌株。

1.2.1.2 復(fù)篩 將初篩后得到的菌株接入液體種子培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)15h后接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在溫度為25℃，150r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)96h，取粗酶液測(cè)定果膠酶活性。

1.2.1.3 酶活力的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)［5］，以Sigma公司的桔子果膠為底物，用次亞碘酸法定量測(cè)定，所生成的半乳糖醛酸量表示果膠酶的活力。酶活力的定義為:在pH5.8，25℃下，1h酶促化果膠分解生成1mg游離半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。

1.2.2 低溫果膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.2.1 低溫果膠酶最適酶反應(yīng)溫度的測(cè)定 在pH為3.5的條件下，取不同溫度，分別測(cè)定粗酶液的酶活力，確定最適酶反應(yīng)溫度。

1.2.2.2 低溫果膠酶的溫度穩(wěn)定性 將酶液在不同溫度下分別放置30min，在pH為3.5，溫度為25℃的條件下，測(cè)定殘余酶活力，確定酶活穩(wěn)定溫度范圍。

1.2.2.3 低溫果膠酶熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于不同溫度下，每隔30min測(cè)定殘余酶活力，確定酶熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.2.4 低溫果膠酶的最適酶反應(yīng)pH 分別配制不同pH的緩沖液，在25℃條件下，分別測(cè)定粗酶液的酶活力，確定最適酶反應(yīng)pH。

1.2.2.5 低溫果膠酶的穩(wěn)定pH范圍測(cè)定 用不同pH的緩沖液與粗酶液分別按4∶1體積混合，4℃保存12h。分別測(cè)定酶活力，確定最適酶反應(yīng)pH范圍。

1.2.2.6 金屬離子對(duì)低溫果膠酶酶活力的影響 將不同金屬鹽用pH為5.8的檸檬酸－檸檬酸納緩沖液溶解，配制成物質(zhì)量濃度為2mmol/L的含金屬鹽的緩沖液，在25℃分別測(cè)定粗酶液的活力。

1.2.2.7 低溫果膠酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定［6］采用Lineweave－Burk雙倒數(shù)法作圖，求得Km與Vmax。

1.2.3 低溫果膠酶粗酶液的純化 將粗酶液分別采用硫酸銨一次沉淀法、SephadexG2－100凝膠過(guò)濾法和DEAE52－cellulose離子交換層析法進(jìn)行分離純化，并分別測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)的含量和酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶產(chǎn)生菌的篩選

表1 低溫果膠酶產(chǎn)生菌篩選結(jié)果

從采集的土樣中經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、初篩，挑選在篩選平板上生長(zhǎng)速度快并產(chǎn)生明顯透明圈，且H/C(H為透明圈直徑，C為菌落直徑)大的菌株搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩。最后得到6株產(chǎn)酶特性較佳的菌株，其中一株生長(zhǎng)較快，經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)產(chǎn)酶特性穩(wěn)定，菌種定名為L(zhǎng)P272，并以其為研究菌株進(jìn)行果膠酶酶學(xué)特性的初步研究。

2.2 菌株LP272的生化鑒定

菌株LP272經(jīng)生化鑒定儀鑒定后，結(jié)果如表2。

表2 菌株LP272生化鑒定結(jié)果

通過(guò)VITEK32自動(dòng)鑒定儀測(cè)定，其結(jié)果為指甲隱球酵母(Cryptococcus nuiguttulatus)。

2.3 低溫果膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 低溫果膠酶最適酶反應(yīng)溫度的測(cè)定 結(jié)果如圖1。

圖1 最適酶反應(yīng)溫度曲線

由圖1可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶的最適酶反應(yīng)溫度為25℃，且為低溫果膠酶。該酶在不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，呈現(xiàn)出較為典型的鐘形曲線。

2.3.2 低溫果膠酶的溫度穩(wěn)定性 結(jié)果如圖2。

由圖2可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶在25℃以下保存時(shí)，酶活性變化不大。在30℃的條件下保存30min，酶活力仍然保留了95.2%，即使當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，酶活性還保留了65%，這一現(xiàn)象說(shuō)明菌株LP272所分泌的低溫果膠酶對(duì)常溫有一定的抵抗能力。

2.3.3 低溫果膠酶的熱穩(wěn)定性 結(jié)果如圖3。

圖2 酶的溫度穩(wěn)定性曲線

圖3 酶的熱穩(wěn)定性曲線

由圖3可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶，在25℃保溫3h，酶活力降低至50.5%;35℃保溫2h，酶活力降低至50.1%;45℃保溫1.5h，酶活力降低至48.7%;55℃保溫1h，酶活力降低至43.1%。

2.3.4 低溫果膠酶最適酶反應(yīng)pH的確定 結(jié)果如圖4。

圖4 最適酶反應(yīng)pH曲線

由圖4可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶在酶反應(yīng)pH為5.8時(shí)酶活力最高。當(dāng)pH小于5.8時(shí)，隨著緩沖液酸性的減弱，酶活力逐漸變大;但當(dāng)pH大于5.8時(shí)，酶活力顯著減小，當(dāng)緩沖液顯堿性時(shí)，酶活力繼續(xù)下降。2.3.5 低溫果膠酶的穩(wěn)定 pH范圍測(cè)定 結(jié)果如圖5。

圖5 酶的穩(wěn)定pH范圍曲線

由圖5可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶pH穩(wěn)定范圍在pH5～6.4，當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí)，酶活力保留了55.7%，pH達(dá)到8.0時(shí)，酶活力只保留了25.1%，說(shuō)明堿性環(huán)境不利于低溫果膠酶的保存。

2.3.6 金屬離子對(duì)低溫果膠酶酶活力的影響 結(jié)果如圖6。

圖6 金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖 6可知，Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+對(duì)低溫果膠酶有激活作用，其作用大小的順序?yàn)镃a2+> Mg2+>Zn2+>Mn2+>Fe2+>Na+，而 Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+對(duì)低溫果膠酶有強(qiáng)烈的抑制作用，其作用大小的順序?yàn)镠g2+>Pb2+>Cu2+>Fe3+>Ba2+。

2.3.7 低溫果膠酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù) 將果膠分別配制成濃度為5、10、15、20、30mg/mL，在25℃、pH5.8的條件下，測(cè)定酶活力，利用Lineweave－Burk雙倒數(shù)法作圖求出低溫果膠酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果如圖7。

圖7 以果膠為底物的Lineweave－Burk圖

利用公式:1/V=1/Vmax+(Km/Vmax)·(1/［S］)，求出低溫果膠酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，當(dāng)以果膠為底物時(shí)，Km為27.86mg/mL，Vmax為152.13μmol/(min·mL)。2.3.8 低溫果膠酶的分離純化 結(jié)果如表3。

表3 分離純化結(jié)果

由表3可知，采用不同的處理方法均使低溫果膠酶得到純化。但綜合純化倍數(shù)、比活力及回收率三項(xiàng)指標(biāo)，40%～85%的硫酸銨分級(jí)沉淀純化效果最好，純化倍數(shù)為2.449倍，比活力為691.86U/mg，回收率為86.97%。

3 結(jié)論

從采集的土樣中篩選到一株產(chǎn)低溫果膠酶的菌株LP272，經(jīng)鑒定該菌屬于指甲隱球酵母。其產(chǎn)生的低溫果膠酶最適酶反應(yīng)溫度為25℃，最適酶反應(yīng)pH為pH5.8;粗酶液在25℃保溫3h，酶活降至50.5%，在35℃保溫2h，酶活降至50.1%，在45℃保溫1.5h，酶活降至48.7%，在55℃保溫1h，酶活降至43.1%;該酶的pH穩(wěn)定范圍在pH5～6.4;金屬離子 Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+對(duì)低溫果膠酶有激活作用，而B(niǎo)a2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+對(duì)低溫果膠酶有強(qiáng)烈的抑制作用;當(dāng)以果膠為底物時(shí)，該酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為27.86mg/mL，Vmax為152.13μmol/(min·mL);采用不同的處理方法均使低溫果膠酶得到純化，但40%～85%的硫酸銨分級(jí)沉淀純化效果最好。

［1］郭愛(ài)蓮，張紅蓮，馮琛.某些物質(zhì)對(duì)細(xì)菌Xg－02果膠酶活性的影響［J］.西北輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，19(1):18－21.

［2］張樹(shù)政.酶制劑工業(yè)(下)［M］.北京:科學(xué)出版社，1984:625－634.

［3］江潔，劉曉蘭，等.果膠酶活性分光光度測(cè)定方法的研究［J］.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，14(1):63－66.

［4］Alkorta L，Garbisu G，Llama MJ，et al.Industrial application of pectic enzymes:a review［J］.Process Biochem，1998，33:21－28.

［5］郭愛(ài)蓮，王少輝，劉忠.產(chǎn)果膠酶芽孢桿菌Xg－01的分離、篩選及發(fā)酵條件的研究［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1997(2):53－56.

［6］Ullah A H J.Prep Biochem［J］，1998，18:443－458.

Study on purification and characteristics of the cold adapted pectinase

WANG Wei1，LI Feng2，ZHANG Lei3，MAO Jun4
(1.College of Food Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;2.College of Chemical Engineering，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;3.Academic Affairs Office，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;4.Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 830091，China)

The strain producing cold adapted pectinase was screened，and the characteristics of cold adapted pectinase，purification and kinetic constant were studied.The results showed that:the optimal temperature and pH for the enzyme reaction was 25℃ and 5.8，the enzyme was stable at pH5～6.4，after 3h at 25℃，the enzyme activity was 50.5%，at 35℃for 2h，the enzyme activity was 55.1%，at 45℃ for 1.5h，the enzyme activity was 48.7%，at 55℃ for 1h，the enzyme activity was 43.1%.The metal ion Mg2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，Na+enhanced the cold adapted pectinase activity，but the metal ion Ba2+，Hg2+，Cu2+，F(xiàn)e3+，Pb2+inhibited the cold adapted pectinase activity strongly.The kinetic constant of the cold adapted pectinase was Km value 27.86mg/mL and Vmax 152.13μmol/(min·mL)when pectin(sigma)as a substrate.The cold adapted pectinase was purified by ammonium sulfate salted out and the optimal range of ammonium sulfate saturation was 40%～85%.

cold adapted pectinase;the optimal temperature for the enzyme reaction;the optimal pH for the enzyme reaction;purification

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)04－0162－04

2009－10－10

王偉(1978－)，男，講師，研究方向:微生物發(fā)酵工程。