膜技術(shù)純化大豆糖蜜發(fā)酵液的研究

趙 華

(北京工商大學(xué)，北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048)

膜技術(shù)純化大豆糖蜜發(fā)酵液的研究

趙 華

(北京工商大學(xué)，北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048)

利用膜技術(shù)去除大豆糖蜜發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)和脂肪成分，并通過(guò)納濾濃縮發(fā)酵液，提高低聚糖的純度。通過(guò)單因素變量法，即超濾膜截留分子量、透析比、pH和反應(yīng)溫度的變化對(duì)大豆蜜糖發(fā)酵液中蛋白、脂肪的去除效果進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明:超濾膜截留分子量為10000Da，透析比為3∶1，pH=7.0，反應(yīng)溫度為室溫的條件下對(duì)大豆蜜糖發(fā)酵液中蛋白質(zhì)和脂肪去除效果最好。

大豆糖蜜發(fā)酵液，膜技術(shù)，低聚糖，脂肪，蛋白質(zhì)

大豆糖蜜是以脫脂大豆粕為原料，醇法制備大豆?jié)饪s蛋白過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品［1－3］。大豆糖蜜呈棕色，性粘稠且具有微甜的風(fēng)味。大豆糖蜜的主要成分為糖類，如固形物含量為50%的大豆糖蜜中一般含有36%的糖類、6%的蛋白質(zhì)、5%的脂肪及3%的灰分［4－5］。大豆糖蜜發(fā)酵液是大豆糖蜜通過(guò)微生物發(fā)酵去除了蔗糖后剩下的液體，其中的主要成分是大豆低聚糖，如棉子糖和水蘇糖等。大豆低聚糖具有安全、穩(wěn)定、甜度低和熱值低等特性，而且大豆低聚糖對(duì)人體具有特殊的保健作用，它在人體內(nèi)可促使腸道雙歧桿菌增殖，從而抑制體內(nèi)腐敗菌的繁殖，具有提高人體免疫力，延緩衰老的作用，因而作為功能性食品基料被廣泛應(yīng)用。利用膜分離技術(shù)可以純化大豆糖蜜發(fā)酵液［6－8］。膜分離技術(shù)是近代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要用于凈化、濃縮、分級(jí)大分子或細(xì)小膠體物。超濾技術(shù)由于其工藝簡(jiǎn)單、能耗低、分離完全等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在食品、醫(yī)藥、水處理以及新興的生物技術(shù)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用［9－11］。納濾介于超濾與反滲透之間，集分離純化與濃縮功能于一身，此外，它還具有節(jié)能及環(huán)境友好等特點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)［12－14］。本實(shí)驗(yàn)將超濾膜技術(shù)運(yùn)用于純化大豆糖蜜發(fā)酵液，去除蛋白質(zhì)和脂肪，并通過(guò)納濾濃縮發(fā)酵液，來(lái)提高低聚糖的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆糖蜜發(fā)酵液(粘稠液體) 大豆糖蜜經(jīng)過(guò)釀酒酵母C發(fā)酵后的溶液，實(shí)驗(yàn)室自制;釀酒酵母C(Saccharomyces cerevisiae) 購(gòu)自CICC;濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、氫氧化鈉、乙醚、石油醚、無(wú)水乙醇等均為分析純;牛血清蛋白(分子量為68000)、VB12(分子量為 1355.38)、氧化性谷胱甘肽(分子量為612.63) 均由北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所提供。

膜分離裝置、中空纖維超濾膜(截留相對(duì)分子量MWCO為10000、30000、100000Da，最大進(jìn)口壓力0.2MPa，使用溫度5～45℃，酸堿度pH2～13)、納濾膜(截留相對(duì)分子量為500Da) 均為天邦膜技術(shù)國(guó)家工程研究中心有限公司提供;PHS－30型pH計(jì) 上海精科雷磁;高效液相色譜儀 北京島津醫(yī)療器械有限公司;手持糖度計(jì) 北京陽(yáng)光億事達(dá)貿(mào)易有限公司;KQ250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;水環(huán)式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要成分分析方法 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:凱氏定氮法［15］;總脂的測(cè)定:堿式乙醚法;膜通量的測(cè)定:以單位時(shí)間得到的透過(guò)液體積計(jì)量;低聚糖的HPLC檢測(cè)條件確定為:Hypersil－NH2柱(250mm×4.6mm，5μm);示差檢測(cè)器;流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30(V/V);流速:1mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.2 大豆糖蜜中蛋白分子量分布的測(cè)定 將大豆糖蜜發(fā)酵溶液和水以100g∶1L的比例配制，過(guò)濾，濾液用凝膠色譜柱進(jìn)行分離，收集對(duì)應(yīng)于層析圖譜中各個(gè)吸收峰的洗脫液，分別進(jìn)行分子量的測(cè)定。

1.2.3 糖分的測(cè)定 將大豆糖蜜發(fā)酵溶液以3500r/min離心5min，取3mL上清液，加入7mL無(wú)水乙醇，混合均勻，離心取上清液加2‰的活性炭對(duì)糖液進(jìn)行脫色，加熱攪拌30min，趁熱過(guò)濾，濾液稀釋至折光為2.0Brix后，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾得到待分析糖液，然后用HPLC法對(duì)糖液進(jìn)行檢測(cè)。用面積歸一化法計(jì)算低聚糖的純度。

1.2.4 超濾工藝的研究

1.2.4.1 大豆糖蜜發(fā)酵液的預(yù)處理 將大豆糖蜜發(fā)酵溶液和水以100g∶1L的比例配制，待充分溶解混勻后，用鹽酸調(diào)pH4.0或7.0，然后以轉(zhuǎn)速4000r/min離心分離20min，取上清液作為超濾研究的原料。

1.2.4.2 膜過(guò)濾工藝條件 為考察透過(guò)液中總糖濃度隨超濾時(shí)間的變化情況，分別在固定時(shí)間段內(nèi)取樣并測(cè)定折光值，并在超濾結(jié)束后分別測(cè)定透過(guò)液和截留液的可溶性固形物含量。

為了提高糖分的透過(guò)率，采用了內(nèi)壓式切向流過(guò)濾方式，即在過(guò)濾過(guò)程中，只有部分水分透過(guò)超濾膜，另一部分水分與大分子雜質(zhì)等一起形成濃縮液從超濾膜的另外端排出。超濾過(guò)程中，當(dāng)料液體積減少而濃度提高到一定程度后加水稀釋，再進(jìn)行超濾。具體操作可視透過(guò)速度顯著降低時(shí)，分多次加入等體積的水繼續(xù)超濾，直至透過(guò)液中可溶性固形物含量降至0.1Brix以下終止過(guò)濾。

1.2.4.3 膜原件的清洗 正洗:無(wú)壓力條件下，控制蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速90r/min，用純凈水沖洗約10min。反洗:用1L 5%氫氧化鈉溶液沖洗，再用純凈水清洗至中性。

1.2.5 納濾工藝的研究 納濾是介于反滲透和超濾之間的膜分離過(guò)程。納濾膜多為荷電膜，故除可截留糖和有機(jī)小分子外，還可通過(guò)膜電荷與溶質(zhì)電荷間的作用排斥二價(jià)鹽和解離的有機(jī)酸。它是以壓力差為推動(dòng)力，用復(fù)合于微孔基膜上，具有納米級(jí)孔徑的超薄分離層對(duì)大分子和小分子物質(zhì)進(jìn)行分離，可通過(guò)一種操作同時(shí)完成滲析和濃縮的兩個(gè)工藝過(guò)程［16］。

實(shí)驗(yàn)以大豆糖蜜發(fā)酵液超濾后的透過(guò)液作為原料，依然采用了內(nèi)壓式切向流過(guò)濾的方式，分析透過(guò)液和濃縮液成分變化來(lái)衡量納濾濃縮是否可行。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆糖蜜及發(fā)酵液中脂肪蛋白含量

為了考察料液處理過(guò)程中組成變化，對(duì)預(yù)處理前后大豆糖蜜及發(fā)酵液蛋白和脂肪含量進(jìn)行了測(cè)試。預(yù)處理前后大豆糖蜜及發(fā)酵液中蛋白含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示，大豆糖蜜及發(fā)酵液中脂肪含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.45%和0.098%。

表1 預(yù)處理前后大豆糖蜜及發(fā)酵液中蛋白含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)

由此可知，大豆糖蜜原液或發(fā)酵液中主要雜質(zhì)為雜蛋白，后續(xù)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)去除蛋白質(zhì)，脂肪只作為次要考慮因素。

2.2 大豆糖蜜發(fā)酵液中蛋白分子量分布

標(biāo)樣色譜圖如圖1所示。對(duì)于凝膠柱，分子量越大越不容易吸附，所以保留時(shí)間越短。

圖2是發(fā)酵液原液樣品色譜圖?？梢钥闯觯l(fā)酵液原液樣品保留時(shí)間為10.883min，說(shuō)明它的分子量低于谷胱甘肽，即小于612.63Da。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)得知，大豆糖蜜中蛋白有大分子的蛋白和一些分子量較低的球蛋白和多肽及一些酚類等，目前工業(yè)化應(yīng)用成熟的超濾膜截留分子量都在10000Da以上。

圖2 樣品色譜峰

2.3 超濾膜的選擇

超濾的目的主要是為了除去雜蛋白。根據(jù)大豆糖蜜分子量分布的相關(guān)資料，共選用截留分子為10000、30000、100000Da的中空纖維膜進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中料液的pH為7.0，在室溫下進(jìn)行。

根據(jù)文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)室條件選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。泵速:90r/min;原液量:1000mL;透析比:2100/1000;流量:約22mL/min。

2.3.1 不同截留分子量膜的通透性比較 采用不同截留分子量的超濾膜對(duì)料液進(jìn)行過(guò)濾，透過(guò)液體積隨時(shí)間變化如圖3所示。

圖3 不同截留分子量的膜過(guò)濾透過(guò)液體積隨時(shí)間的變化

采用不同截留分子量的超濾膜對(duì)料液進(jìn)行過(guò)濾，透過(guò)液中可溶性固形物含量隨時(shí)間變化如圖4所示。

圖4 不同截留分子量的膜過(guò)濾透過(guò)液中可溶性固形物含量隨時(shí)間的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超濾過(guò)程中膜通量在150min時(shí)仍可維持恒定數(shù)值，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)采用的內(nèi)壓式切向流過(guò)濾方式適合于大豆糖蜜發(fā)酵液的分離;選用3種不同截留分子量的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾時(shí)，膜通量及透過(guò)液中的可溶性固形物含量沒(méi)有明顯區(qū)別。

2.3.2 過(guò)濾前后低聚糖成分變化 超濾前大豆糖蜜發(fā)酵液的HPLC譜如圖5所示，選用3種不同截留分子量的超濾膜過(guò)濾后料液的HPLC譜如圖6～圖8所示。

圖5 超濾前糖蜜發(fā)酵液HPLC圖

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)濾前后低聚糖含量無(wú)明顯變化，且MWCO越小，除雜效果越好，所以選擇截留分子量為10000Da的中空纖維膜去除雜蛋白和脂肪。

圖6 MWCO100000膜超濾后糖蜜發(fā)酵液HPLC圖

圖7 MWCO30000膜超濾后糖蜜發(fā)酵液HPLC圖

圖8 MWCO10000膜超濾后糖蜜發(fā)酵液HPLC圖

2.4 透析比和pH對(duì)膜過(guò)濾過(guò)程的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程力求維持通量恒定，所以當(dāng)通量開(kāi)始明顯下降時(shí)加入與殘留液等體積的純凈水，直至過(guò)濾完成(透過(guò)液折光為0Brix)，所加入的水量約為原液的三倍，所以，最終確定透析比為3∶1。而在pH=7.0和pH=4.0條件下分別測(cè)定每10min得到透過(guò)液的體積，其流量變化如圖9。

圖9 不同pH條件下每10min透過(guò)液體積隨時(shí)間的變化

由圖9可知，pH對(duì)膜通量有著較大的影響，在pH為4.0條件下，通量迅速下降，加入純凈水稀釋后才有所恢復(fù)，而在中性pH為7.0條件下，膜通量的下降得較少，經(jīng)分析這可能是因?yàn)樘幱诘入婞c(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子很易沉積在膜表面，使透過(guò)阻力增加，透過(guò)通量下降。所以實(shí)驗(yàn)中將預(yù)處理后的大豆糖蜜發(fā)酵液的pH調(diào)回中性后再進(jìn)入超濾膜過(guò)濾。

2.5 料液溫度對(duì)膜過(guò)濾過(guò)程的影響

根據(jù)膜的溫度承受范圍，分別控制溫度為20、30、40℃，觀察膜流量變化，結(jié)果如圖10所示。可知溫度對(duì)膜過(guò)濾過(guò)程的影響很小，綜合成本等考慮，選擇在室溫條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖10 不同溫度條件下每10min透過(guò)液體積隨時(shí)間的變化

2.6 在優(yōu)化條件下大豆糖蜜發(fā)酵液中蛋白脂肪去除效果

經(jīng)過(guò)以上多次單因素實(shí)驗(yàn)，選定膜過(guò)濾相關(guān)參數(shù)條件為:膜截留分子量為10000Da，室溫，大豆糖蜜發(fā)酵液稀釋液pH=7.0，透析比為3∶1。經(jīng)過(guò)濾后雜蛋白和脂肪含量變化如表2所示。

表2 膜過(guò)濾前后的蛋白質(zhì)和脂肪含量

2.7 納濾濃縮工藝的初步探索

用截留分子量為500Da的納濾設(shè)備處理超濾好的透過(guò)液，圖11為納濾前的溶液、納濾濃縮液和納濾透過(guò)液的HPLC圖。由圖中可以看出，納濾前后的溶液的低聚糖成分無(wú)顯著變化，透過(guò)液中無(wú)糖分，納濾達(dá)到了濃縮糖液的效果。最終將膜過(guò)濾后的糖蜜發(fā)酵液濃縮至45Brix，以便下一步工業(yè)色譜分離糖液。

圖11 納濾處理前后糖分變化的HPLC圖

3 結(jié)論

大豆糖蜜發(fā)酵液中脂肪含量不高，且經(jīng)膜(10000 dalton膜組件)過(guò)濾后截留效果能達(dá)到99%的去除率。大豆糖蜜發(fā)酵液中蛋白質(zhì)經(jīng)膜過(guò)濾后截留率很低，經(jīng)膜過(guò)濾后能達(dá)到36%的去除率，還需要進(jìn)一步研究，確定蛋白質(zhì)在大豆糖蜜中的存在形式。

研究結(jié)果表明:超濾膜截留分子量為10000Da，透析比為3∶1，大豆糖蜜發(fā)酵液稀釋液pH=7.0，反應(yīng)溫度為室溫的條件下，大豆蜜糖發(fā)酵液中蛋白、脂肪去除效果最好。經(jīng)納濾處理后有效低聚糖成分無(wú)損失，濃縮方法可行。

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Purification of soybean molasses fermentation through membrane technology

ZHAO Hua
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

The purpose of the project was to increase the purity of oligosaccharides by membrane technology to remove soybean molasses fermentation of protein and fat content，fermenting broth by nanofiltration.The single factor variables，namely，membrane molecular weight cutoff dialysis ratio，pH and reaction temperature on the fermentation of soybean protein in honey，fat removal were studied.The results showed that ultrafiltration membrane MWCO(molecular weight cutoff)of 10000Da，dialysis ratio of 3∶1，pH of 7.0 and room temperature were the best reaction conditions on the removal of honey fermentation of soybean protein and fat.That improved the product purity of oligosaccharides best.

soybean molasses fermentation;membrane technology;oligosaccharide;fat;protein

TS201.1

B

1002－0306(2011)04－0306－04

2010－12－17

趙華(1965－)，男，博士，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用。

國(guó)家“863”資助項(xiàng)目(2007AA100404)。