利用煙末酶解液制備煙用美拉德反應(yīng)香精的研究

唐 勝，沈光林，饒國華，趙謀明，*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640;2.廣東中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，廣東廣州510145)

利用煙末酶解液制備煙用美拉德反應(yīng)香精的研究

唐 勝1，沈光林2，饒國華2，趙謀明1，*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640;2.廣東中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，廣東廣州510145)

用蛋白酶酶解煙末，將酶解液濃縮，外加氨基酸進行美拉德反應(yīng)。通過單因素實驗確定最適反應(yīng)條件為:選用L－天冬氨酸，氨基酸加量3%(w/w)，初始pH6.5，反應(yīng)時間3h。評吸結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件下得到的美拉德反應(yīng)香精能顯著增加卷煙的香味，降低刺激性，改善吸味。通過固相微萃取(SPME)提取反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分，用氣相色譜－質(zhì)譜法(GC－MS)分析，得到27種主要揮發(fā)性成分，其中包括巨豆三烯酮、呋喃酮、吡喃酮等對煙草香味貢獻較大的風味物質(zhì)。

煙末酶解，美拉德反應(yīng)，煙用香精

煙末是煙葉切絲過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，我國煙草植物栽培與產(chǎn)量均居世界首位，每年煙葉產(chǎn)量約240萬t，其中約有25%的煙末、煙葉等下腳料不能用于卷煙生產(chǎn)［1］。目前對煙末的開發(fā)利用主要是用于提取茄尼醇、果膠、氨基酸、煙堿，進行高溫堆肥等［2－6］，附加值較低。優(yōu)質(zhì)烤煙中還原糖含量約為14%～18%，蛋白質(zhì)含量約為6%～9%［7］，將烤煙煙末中還原糖提取出來，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，進行美拉德反應(yīng)制備煙用香精是煙末高值化利用的一條途徑。美拉德反應(yīng)香精由于其天然、健康和安全的特點，越來越受到人們的青睞。本工作擬以煙末為原料，通過酶解、美拉德反應(yīng)制備煙用香精，并利用SPME－GC－MS對香精進行分析，為煙末的高值化利用提供了理論與方法的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

煙末 由廣東中煙公司提供，為烤煙煙末，蛋白質(zhì)含量7.00%，還原糖含量14.50%，40℃烘干，粉碎，過80目篩;Alcalase2.4L、Flavorzyme500MG 由丹麥諾維信公司提供;其他試劑 均為分析純。

DSQⅡ氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Thermo公司;100μm PDMS固相微萃取頭 美國SUPELCO公司;高效液相色譜儀 美國Waters公司;TIM840自動電位滴定儀 上海摩達科學器材公司;SHZ－82水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠;GL－21M高速冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

上海亞榮儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)基液的制備 將一定量煙末置于錐形瓶中，按照1∶5料液比加水，用Alcalase 2.4L與Flavorzyme 500MG 1∶1復(fù)配酶解，總加酶量為5‰(以煙末重量計)，在(50±2)℃恒溫水浴振蕩器中振蕩酶解8h，在8000r/min、20℃條件下離心20min，取上清液，濃縮至固形物含量50%±2%。

表1 評分標準

1.2.2 美拉德反應(yīng) 取一定量美拉德反應(yīng)基液，置于玻璃瓶中，加入一定比例氨基酸，調(diào)節(jié)pH，壓蓋密封，在(100±2)℃恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)一段時間，冷卻。

1.2.3 風味評價 對制備出來的每一個樣品用噴霧器噴灑到低檔次煙絲上面，噴霧量為煙絲質(zhì)量的2.0‰左右，經(jīng)相應(yīng)處理后由一個七人小組進行評吸，對其光澤、香氣、諧調(diào)、雜氣、刺激性和余味六個指標分別進行評分，然后算總分求平均值，計分方式見表1。

1.2.4 美拉德反應(yīng)基液及煙末氨基酸分析 采用美國Waters高效液相色譜儀，PICO.TAG氨基酸分析柱，38℃，檢測波長254nm，流速1mL/min條件下進行氨基酸分析。

1.2.5 粗蛋白的測定 凱氏定氮法［8］。

1.2.6 還原糖的測定 直接滴定法［9］。

1.2.7 氨基酸態(tài)氮的測定 甲醛滴定法［10］。

1.2.8 氨基酸態(tài)氮損失率 氨基酸態(tài)氮損失率=(反應(yīng)前體系中氨基酸態(tài)氮－反應(yīng)后體系中氨基酸態(tài)氮)/反應(yīng)前體系中氨基酸態(tài)氮×100%

1.2.9 肽態(tài)氨基酸含量 肽態(tài)氨基酸含量=總氨基酸含量－游離氨基酸含量

1.2.1 0 SPME－GC－MS分析條件

1.2.1 0.1 色譜條件 色譜柱:Tr－35ms彈性石英毛細管(30m×0.25mm×0.25μm);升溫程序:初始溫度40℃，保持 2min，以 10℃/min升溫至 60℃，保持1min，以 3℃/min升溫至 120℃，保持 10min，以12℃/min升溫至250℃，保持10min;載氣:He;載氣流量:1.0mL/min;不分流進樣。

1.2.1 0.2 質(zhì)譜條件 離子源:EI離子源;離子源溫度:250℃;傳輸線溫度:275℃;電子能量:70eV;質(zhì)量范圍:m/z 33～450amu。

1.2.1 0.3 萃取條件 取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物5g置于50mL萃取瓶，加入10mL飽和NaCl溶液，50℃振蕩萃取40min，250℃解吸3min。

2 結(jié)果與討論

2.1 美拉德反應(yīng)基液及煙末氨基酸組成分析

據(jù)相關(guān)文獻報道，L－谷氨酸、L－天冬氨酸、L－苯丙氨酸、L－脯氨酸、L－精氨酸與葡萄糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對煙草有較好的增香效果，且香味諧調(diào)［11］。從表2可以看出，在這五種氨基酸在煙末中、美拉德反應(yīng)基液總氨基酸、游離氨基酸、肽態(tài)氨基酸中含量分別為:35.35%，42.82%，36.15%，45.30%，而美拉德反應(yīng)基液中游離氨基酸僅為總氨基酸的24.89%。說明煙末中含較多有利于制備煙用美拉德香精的氨基酸，經(jīng)過蛋白酶酶解后，這些氨基酸大部分以肽態(tài)氨基酸存在，少部分為游離氨基酸，因此，在美拉德反應(yīng)中外加一定量的游離氨基酸有利于提高美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風味。

表2 美拉德反應(yīng)基液及煙末氨基酸組成

2.2 美拉德反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化

以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物評分為指標，篩選美拉德反應(yīng)中所加氨基酸種類，氨基酸加量，反應(yīng)體系初始pH和反應(yīng)時間。

2.2.1 氨基酸種類對美拉德反應(yīng)程度及產(chǎn)物品質(zhì)的影響 不同氨基酸種類對美拉德反應(yīng)物風味影響很大，應(yīng)根據(jù)所需風味特征選用不同種類的氨基酸，如制備肉香型美拉德反應(yīng)產(chǎn)物較多選用含硫的半胱氨酸及其鹽酸鹽。本實驗?zāi)康氖侵苽淠苄揎棢煵蒿L味的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，參考相關(guān)文獻［11］，選用五種氨基酸進行對比，如圖1所示。由圖1可以看出，反應(yīng)體系中氨基酸態(tài)氮損失率最高的為L－精氨酸，說明其反應(yīng)程度最高，而品評的結(jié)果顯示L－天冬氨酸效果最好。因此選用L－天冬氨酸作為外加氨基酸。

2.2.2 氨基酸加量對美拉德反應(yīng)程度及產(chǎn)物品質(zhì)的影響 氨基酸與反應(yīng)體系中還原糖的比例會對Maillard反應(yīng)產(chǎn)生明顯的影響，當氨基酸加量不足時，會導(dǎo)致美拉德反應(yīng)程度不夠，產(chǎn)物風味不明顯;而氨基酸加量過多時，則一方面增加了反應(yīng)成本，另一方面也會對產(chǎn)物風味產(chǎn)生負面影響，如氨基酸本身熱解可能會產(chǎn)生的一些對風味不利的物質(zhì)。由圖2可以看出，隨著氨基酸加量的增加，氨基酸態(tài)氮損失率不斷升高，而評價結(jié)果顯示加量為3%(以反應(yīng)基液重量計)時效果最好。因此L－天冬氨酸的加量選擇3%。

圖1 氨基酸種類對氨基酸態(tài)氮損失率及產(chǎn)物品質(zhì)的影響

圖2 氨基酸加量對氨基酸態(tài)氮損失率及產(chǎn)物品質(zhì)的影響

圖3 初始pH對氨基酸態(tài)氮損失率及產(chǎn)物品質(zhì)的影響

2.2.4 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)程度及產(chǎn)物品質(zhì)的影響 由圖4可知，隨著反應(yīng)時間的延長，氨基酸態(tài)氮損失率提高，反應(yīng)程度加深。在一定范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，產(chǎn)物風味變得濃郁，但是超過一定時間，會出現(xiàn)焦味。根據(jù)品評的結(jié)果，選擇反應(yīng)時間為3h。

2.3 反應(yīng)產(chǎn)物SPME－GC－MS分析

將煙末按照優(yōu)化的工藝條件制備美拉德反應(yīng)香精，并添加到卷煙中進行品評，評吸得分為94.5分，表明該香精能顯著降低卷煙的刺激性，增加香味，改善吸味。根據(jù)1.2.10的條件對該香精進行色譜分析，結(jié)果如圖5與表2所示。

圖4 反應(yīng)時間對氨基酸態(tài)氮損失率及產(chǎn)物品質(zhì)的影響

圖5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物色譜圖

經(jīng)SPME－GC－MS分析得到產(chǎn)物中主要揮發(fā)性成分27種，其中包括雜環(huán)類9種，酯類6種，酮類6種，醇類3種，有機酸2種。巨豆三烯酮為煙草中的重要香味物質(zhì)［12］，相對百分含量達1.01%;呋喃酮、吡喃酮、苯并吡喃等雜環(huán)類化合物相對百分含量達33.57%，這些成分大部分由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，對煙草香味有著很好的修飾作用。由此可見以煙末為原料，通過酶解、美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的煙草香精既能保持原有煙草香味，又能進一步改善煙草的風味。

3 結(jié)論

本文以煙末為原料，通過蛋白酶酶解制備美拉德反應(yīng)基液，優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件，得到了優(yōu)化條件下的煙用美拉德反應(yīng)香精，感官評價的結(jié)果表明該香精對卷煙有顯著的增香、降低刺激、改善余味功效。將反應(yīng)產(chǎn)物進行SPME－GC－MS分析，得到主要揮發(fā)性成分27種，其中包括巨豆三烯酮、呋喃酮、吡喃酮等對煙草香味有積極貢獻的風味化合物。結(jié)果表明，將煙末通過美拉德生香反應(yīng)制備煙用香精可為煙末高值化利用提供一條切實可行的途徑。

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Study on preparation of Maillard tobacco flavoring with tobacco powder hydrolysate solutions

TANG Sheng1，SHEN Guang－lin2，RAO Guo－h(huán)ua2，ZHAO Mou－ming1，*
(1.College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China;2.Technology Center，China Tobacco Guangdong Industrial Corporation，Guangzhou 510145，China)

Protease was used to hydrolyze tobacco powder，amino acid was added to the concentrated hydrolysate solutions for Maillard reaction.Based on the results of single factor test，the optimized reaction conditions were as follows:amino acid kind L－aspartic acid，amino acid addition 3%(w/w)，initial pH 6.5，reaction time 3h.The method of SPME to was chosen to extract the volatile compounds of the Maillard reaction products.Through the analysis of GC/MS，27 main volatile compounds were obtained，including megastigmatrienone，furanone，pyrone，etc，which contributed a lot to the flavor of tobacco.

tobacco powder hydrolysis;Maillard reaction;tobacco flavoring

TS201.2+5

B

1002－0306(2011)04－0268－04

2010－05－04 *通訊聯(lián)系人

唐勝(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

粵煙工(05XM－QK［2008］－001);粵煙工(05XM－QK［2008］第020號)。

表3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要揮發(fā)性成分