費(fèi)菜總黃酮提取工藝的研究

劉 飛，王鴻飛，林 燕，毛方華

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江寧波315211)

費(fèi)菜總黃酮提取工藝的研究

劉 飛，王鴻飛*，林 燕，毛方華

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江寧波315211)

采用乙醇浸提、超聲波輔助的方法從費(fèi)菜葉中提取總黃酮，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化，采用紫外分光光度法測定總黃酮含量。其適合的工藝條件為:超聲時(shí)間50min，乙醇濃度90%，料液比1∶50，乙醇浸提液pH9，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間6h，在此工藝條件下總黃酮的得率為5.822%。

費(fèi)菜，總黃酮，超聲輔助提取，紫外分光光度法

植物黃酮(flavonoids)是一類低分子天然植物成分，廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中，毒副作用小，是目前人們比較關(guān)注的一類化合物。有很多藥用植物的主要活性成分都是黃酮類，包括黃酮、異黃酮、黃酮醇等。最初，黃酮類的粗制品僅在染料方面應(yīng)用，在上世紀(jì)20年代，國外把槲皮素、蘆丁用于臨床后，才開始引起人們的關(guān)注［1］。許多研究表明，黃酮類化合物具有多種生物活性，除利用其抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有顯著效果［2］。黃酮類化合物的提取方法一般有有機(jī)溶劑提取法、堿提酸沉淀法、CO2超臨界流體提取法、超聲波提取法、微波提取法、酶法輔助提取法和加壓流體提取等［3－11］。堿提酸沉法需要控制浸提液的pH，在強(qiáng)堿性下尤其加熱時(shí)會(huì)破壞黃酮母核，酸性過大會(huì)形成佯鹽，致使析出的黃酮類化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。有機(jī)溶劑提取法目前應(yīng)用最為廣泛，如配合超聲、微波和酶輔助，這樣不僅省時(shí)省力，低污染，節(jié)約原料，而且提取率比單純有機(jī)溶劑提取都顯著提高。費(fèi)菜(Sedum kamtschaticum Fisch.)俗稱救心草、景天三七，系景天科景天屬植物費(fèi)菜的帶根全草，始載于《救荒本草》，其性平、味酸;具有活血、止血、寧心、消腫、解毒等功效。民間用于治療跌打損傷、咳血、吐血、便血、心悸、癰腫等疾病。費(fèi)菜含馬栗樹皮素、楊梅樹皮苷、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、楊梅黃素3－葡萄糖苷等黃酮及黃酮甙類［12］。實(shí)驗(yàn)以乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助的方法從費(fèi)菜葉中提取黃酮類化合物，研究費(fèi)菜葉中提取總黃酮的影響因素，并采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行從費(fèi)菜葉中提取總黃酮的工藝條件優(yōu)化，從而為生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費(fèi)菜 采自江蘇沛縣野生蔬菜研究所張寨示范園，摘功能葉干燥備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、結(jié)晶三氯化鋁 均為分析純;水 純水。

WK－200B型高速藥物粉碎機(jī) 山東青州市精誠機(jī)械有限公司;SB3200D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Orion 420A+酸度計(jì)美國Thermo公司;Cary 50 Scan紫外分光光度計(jì) 美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 費(fèi)菜葉總黃酮的提取 將新鮮費(fèi)菜葉在70℃干燥24h，然后用藥物粉碎機(jī)粉碎并過80目篩，稱取一定量的費(fèi)菜葉干粉，105℃干燥2h，使水分含量在0.3%。準(zhǔn)確稱取原料粉末1g置入150mL錐形瓶中，加入一定濃度、一定量的乙醇溶液超聲輔助提取，后轉(zhuǎn)移到恒溫水浴鍋中浸提，提取液趁熱抽濾，得濾液，將濾液作為待測液進(jìn)行含量的測定。

1.2.2 測定波長的確定 測定波長的確定參照文獻(xiàn)［13］。

取4個(gè)25mL容量瓶，編號(hào)1、2、3、4號(hào)，1、2號(hào)各加入1mL樣品液，3、4號(hào)各加入1mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.244mg/mL)，在2、4號(hào)各加入2%AlCl3溶液1mL，4個(gè)容量瓶都用30%乙醇定容，混勻后放置20min，分別置于1cm石英比色皿中，于紫外分光光度計(jì)上在200～800nm波長范圍內(nèi)掃描。

由圖1的掃描圖譜可見，在紫外區(qū)，在30%乙醇溶液中，樣品提取液中總黃酮最大吸收波長為270nm，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長為265nm;在三氯化鋁30%乙醇溶液中，樣品提取液中總黃酮的最大吸收波長為275nm，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長也為275nm。三氯化鋁的存在使樣品黃酮和蘆丁的吸收峰發(fā)生了紅移，使他們的最大吸收波長重合。因此，實(shí)驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品在275nm測定費(fèi)菜葉總黃酮的含量。

圖1 掃描圖譜

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取0.0244g蘆丁(120℃干燥至恒重)，置于100mL容量瓶中，加入適量的30%乙醇，稍加熱溶解，冷卻后用30%的乙醇定容至100mL。此時(shí)蘆丁的濃度為:0.244mg/mL。精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL于10mL比色管中，各加入2%的AlCl3溶液1mL，以30%乙醇定容至刻度，靜置20min。以空白管調(diào)零，在275nm下測定吸光度A，得到的回歸方程為:y=38.631x+0.0016，R=0.9999。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 費(fèi)菜葉總黃酮的測定 分別吸取1mL待測液于10mL容量瓶中用相應(yīng)的乙醇溶液定容，再分別吸取1mL待測液于10mL比色管中，各加入2%的三氯化鋁溶液1mL，以30%的乙醇定容至刻度，靜置20min。以空白管調(diào)零，在275nm下測定吸光度，計(jì)算總黃酮得率。

1.2.5 單因素及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 一般采用乙醇作為提取劑，可以避免有毒和有害物質(zhì)的殘留，采用超聲波輔助萃取，可以加速細(xì)胞的破碎，有利于有效成分的溶出。實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助，通過對(duì)乙醇濃度、料液比、乙醇浸提液pH、超聲時(shí)間等影響費(fèi)菜總黃酮得率的因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳工藝條件。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響 在乙醇濃度90%，料液比1∶40，乙醇浸提液未調(diào)pH，40℃水浴浸提1h的條件下，分別研究超聲10、20、30、40、50、60min對(duì)費(fèi)菜葉總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

從圖3中可見，隨著超聲時(shí)間的延長，總黃酮得率隨之增加，50min后得率增加不大，為了降低時(shí)間和能量消耗，以50min為宜。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響 在料液比1∶40，乙醇浸提液未調(diào)pH，超聲提取50min，40℃水浴浸提1h的條件下，分別研究乙醇濃度60%、70%、80%、90%、95%、100%對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響

由圖4可見，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮得率不斷增加，乙醇濃度為90%時(shí)，達(dá)到最高，乙醇濃度高于90%時(shí)，得率反而下降，可能是由于乙醇濃度過高，其他醇溶性物質(zhì)會(huì)被提出，致使黃酮類化合物溶出率減少。而且隨著乙醇濃度的增高，醇溶性色素也不斷被提取出來，影響測定。所以結(jié)合圖4，確定乙醇濃度90%最為合適。

2.1.3 料液比對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響 在乙醇濃度90%，乙醇浸提液未調(diào)pH，超聲提取50min，40℃水浴浸提1h的條件下，分別研究料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

由圖5可見，隨著浸提液用量的增加，總黃酮得率不斷增加，料液比為1∶50時(shí)得率達(dá)到最高，以后隨著浸提液用量的增加，得率反而下降。綜合考慮提取效果和浸提溶劑用量，以料液比1∶50最為合適。

2.1.4 浸提液pH對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響 在乙醇濃度90%，料液比1∶50，超聲提取50min，40℃水浴浸提1h的條件下，分別研究乙醇浸提液的pH6、7、8、9、10對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 pH對(duì)總黃酮得率的影響

由圖6可見，隨著乙醇浸提液pH的增加，總黃酮得率有所增加，在pH為9時(shí)，得率最高，pH大于9時(shí)，得率迅速下降。這可能是由于堿性過強(qiáng)破壞了黃酮母核，導(dǎo)致含量下降［12］。所以確定 pH9最為合適。

2.1.5 浸提溫度對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響 在乙醇濃度90%，乙醇浸提液pH為9，料液比1∶50，超聲50min，浸提1h的條件下，分別研究水浴浸提溫度40、50、60、70、80℃對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 浸提溫度對(duì)總黃酮得率的影響

由圖7可見，隨著浸提溫度的升高，總黃酮得率不斷升高，當(dāng)浸提溫度高于60℃時(shí)，得率升高不大，所以取60℃作為最佳浸提溫度。

2.1.6 浸提時(shí)間對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響 在乙醇濃度90%，乙醇浸提液 pH9，料液比 1∶50，超聲50min，水浴浸提溫度60℃的條件下，分別研究浸提時(shí)間1、2、3、4、5、6h對(duì)費(fèi)菜總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 浸提時(shí)間總黃酮得率的影響

由圖8可見，隨著浸提時(shí)間的延長，總黃酮得率不斷升高，浸提時(shí)間高于4h時(shí)，得率變化不大，所以最佳浸提時(shí)間以4h為宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以乙醇濃度90%，超聲時(shí)間50min，并以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)計(jì)料液比、乙醇浸提液pH、浸提溫度、浸提時(shí)間為因素，安排四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2中可見，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響主次順序?yàn)?料液比 >浸提時(shí)間 >浸提溫度 >浸提液pH。四種因素的最佳組合為 A2B2C3D3，即料液比1∶50，乙醇浸提液pH9，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間6h。

通過正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定的最佳提取工藝為:超聲時(shí)間50min，乙醇濃度90%，料液比1∶50，乙醇浸提液pH9，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間6h。在此最佳工藝條件下，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測定的平均總黃酮得率為5.822%。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用干燥費(fèi)菜葉粉為原料，以乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)費(fèi)菜葉總黃酮提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明較適宜的操作條件為:超聲時(shí)間50min，乙醇濃度90%，料液比1∶50，乙醇浸提液pH9，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間6h，在該提取條件下，費(fèi)菜總黃酮的得率為5.822%。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在生產(chǎn)上浸提時(shí)間可以縮短為4h，并不影響總黃酮得率。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)費(fèi)菜葉中的總黃酮進(jìn)行了粗提，接下來要進(jìn)行純化，并對(duì)其功能性作進(jìn)一步的研究。

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Study on extraction of total flavonoids from Sedum kamtschaticum Fisch.

LIU Fei，WANG Hong－fei*，LIN Yan，MAO Fang－h(huán)ua
(Department of Food Science and Engineering，Ningbo University，Ningbo 315211，China)

Total flavonoids from Sedum kamtschaticum Fisch.was extracted by ultrasonic wave.On the basis of single－factor experiments，the orthogonal experiment was used in the optimization of technological parameters.The results showed that the optimum conditions were as follows:supersonic time was 50min，ethanol concentration was 90%，ratio of raw material and liquid was 1∶50，pH 9，optimum extraction temperature and time was 60℃ and 6h.By the above conditions，the total flavonoids extraction rate was 5.822%.

Sedum kamtschaticum Fisch;totalflavonoids;ultrasound－ assisted extraction;ultraviolet spectrophotometry

TS201.2

B

1002－0306(2011)04－0252－04

2010－03－24 *通訊聯(lián)系人

劉飛(1983－)，女，碩士，主要從事食品科學(xué)方面的研究。