超聲提取率對(duì)麥冬糖體外清除閎基自由基作用影響的研究

王小梅，薛慧君，孫潤(rùn)廣

(陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062)

超聲提取率對(duì)麥冬糖體外清除閎基自由基作用影響的研究

王小梅，薛慧君，孫潤(rùn)廣*

(陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062)

分別用五種不同的超聲功率從麥冬中提取多糖，并用苯酚－硫酸法檢測(cè)了這五種功率提取麥冬多糖的提取率，用鄰二氮菲－金屬鐵離子－H2O2體系檢測(cè)了其對(duì)羥基自由基的清除作用。結(jié)果表明，超聲提取麥冬多糖的提取率隨超聲功率的增大先減小后增大，而且均具有清除羥自由基的作用，此清除作用隨著濃度的增大而增大，隨著超聲提取功率的增大先增大后減小，當(dāng)超聲功率為560W時(shí)，清除率最高。

麥冬多糖，超聲功率，提取率，羥基自由基

中藥以其良好的藥用效果和較小的毒副作用，已逐漸被人們所接受。藥用成分的有效提取技術(shù)已成為中醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的提取方法主要包括水煮法、壓榨法、浸提法等。水煮法耗時(shí)耗能，單次提取率低;壓榨法提取快，但提取率低;浸提法提取率高，但耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。這些方法或多或少都存在一定的缺陷。超聲提取技術(shù)是一種快捷、省時(shí)、高效的提取手段，已逐步被運(yùn)用到中藥有機(jī)物分析［1］、萃取分離［2］等方面，并取得了很好的效果。雖然超聲萃取已在中藥有效成分的分離中顯示出其明顯的優(yōu)勢(shì)［3－6］，但目前對(duì)超聲萃取，尤其是超聲作用條件(如功率等)的改變對(duì)中藥有效成分結(jié)構(gòu)及生物活性影響尚不清楚，對(duì)其活性影響機(jī)制方面的研究報(bào)道并不多見。超聲對(duì)中藥有效成分提取率、結(jié)構(gòu)、活性、分子量等的影響是一個(gè)值得深入研究的問題。多糖是中藥最主要的有效成分之一。文獻(xiàn)報(bào)道其具有抗癌、抗衰老等功能。并且植物多糖的這些功能與多糖的抗氧化作用密切相關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老的保健食品的評(píng)價(jià)上［7－8］。麥冬為百合科多年生草本植物麥冬的塊根。近年來對(duì)麥冬多糖的生物活性研究表明，麥冬多糖具有多種生物活性，如抗心肌缺血、降血糖、抗過敏活性等方面［9］，具有極大的藥用價(jià)值。本文用超聲技術(shù)提取麥冬多糖，并主要研究了超聲功率的變化對(duì)麥冬多糖的提取率、體外清除羥基自由基作用的影響，為超聲提取中藥多糖對(duì)功率的選擇提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥冬 浙江產(chǎn);95%乙醇、抗壞血酸、鄰二氮菲、過氧化氫、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑 均為分析純。

KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TU－1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JY92－Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;CF16RX高速離心機(jī) 日本日立公司;TB－215D電子天平 精度:1/105g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FD－1A冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥冬多糖的提取 將麥冬塊根60℃烘干后粉碎，加入4倍體積的95%乙醇超聲脫脂三次，烘干。取80g脫脂后的塊根粉末，按料液比1∶10加蒸餾水，攪拌使其充分溶解，放于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下提取，提取條件:超聲時(shí)間10s，間隙時(shí)間15s，超聲次數(shù)90次，超聲功率分別為80、240、400、560、720W。分別提取兩次，兩次的提取液經(jīng)減壓濃縮，用四倍量95%乙醇醇析得粗多糖沉淀，離心，透析，真空干燥后得五種功率提取的麥冬粗多糖。

1.2.2 糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取葡萄糖于105℃烘干，精確稱取20mg，加蒸餾水溶解，定容至100mL，即可得濃度為0.2mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。苯酚溶液的配制:稱取1.25g苯酚，加蒸餾水溶解，定容于25mL棕色容量瓶中，備用。吸取7.5、15、22.5、30、37.5mL的0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于50mL容量瓶中，加水定容;分別吸取上述溶液0.2mL，加苯酚溶液0.4mL，迅速滴加濃硫酸2mL(分析純，d=1.84g/cm3)，搖勻，室溫放置30min，用TU－1810紫外分光光度計(jì)在490nm處測(cè)定吸光度(用蒸餾水代替糖溶液做空白對(duì)照)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，即可得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示，對(duì)應(yīng)的回歸方程為:A=0.00539C+0.00055，相關(guān)系數(shù)R=0.9999。其中:C(μg/mL)為葡萄糖濃度，A為對(duì)應(yīng)的吸光度值。

1.2.2.2 樣品多糖含量的測(cè)定 對(duì)多糖粗提液進(jìn)行抽濾，收集濾液，精確測(cè)定其體積，記作V;取一定量的濾液進(jìn)行稀釋，記錄稀釋因子;精密移取稀釋后的糖溶液0.2mL于10mL試管中，按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟進(jìn)行操作，測(cè)定對(duì)應(yīng)的吸光度A，根據(jù)回歸方程即可求得濾液中的多糖濃度C［10］。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

多糖提取率的計(jì)算:

η(%)=多糖濃度(C)×稀釋因子(f)×濾液體積(V)/原料干重(M)×100%

其中:η為多糖提取率，C為多糖濃度，f為稀釋因子，V為濾液體積，M為原料干重。

1.2.3 麥冬多糖體外清除羥基自由基的作用 采用鄰二氮菲－金屬鐵離子－H2O2體系［11－12］。通過Fenton反應(yīng)生成羥基自由基，促使鄰二氮菲－Fe2+被氧化為鄰二氮菲－Fe3+，造成其水溶液在波長(zhǎng)510nm處最大吸收消失，因此，通過測(cè)定樣品在該波長(zhǎng)處吸光度即可判斷羥基自由基存在的多少。具體步驟為:精密量取 pH7.4磷酸緩沖液(0.05mol/L，PBS，下同)2.0mL和8mL雙蒸水混勻做空白參比管;依次精密量取鄰二氮菲溶液 (5mmol/L，下同)1.0mL，PBS2.0mL，F(xiàn)eSO4溶液(7.5mmol/L，下同)1.5mL和5.5mL雙蒸水，混勻做未損傷管;依次精密量取鄰二氮菲 1.0mL，PBS2.0mL，F(xiàn)eSO4溶液 1.5mL，H2O2(0.1%，下同)1.0mL和4.5mL雙蒸水，混勻做損傷管;依次精密量取鄰二氮菲溶液1.0mL，PBS2.0mL，F(xiàn)eSO4溶液1.5mL，H2O21.0mL，按麥冬多糖終濃度為25、50、100、200、400、800μg/mL分別加入不同濃度的麥冬多糖溶液1.0mL和3.5mL雙蒸水，混勻做樣品管;以抗壞血酸作為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑。各管分設(shè)三個(gè)平行管，將上述試管同時(shí)置于37℃恒溫水浴1h，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度(A)值，用平均值按下式計(jì)算羥自由基清除率:

羥自由基清除率 =［A510nm(加樣)－A510nm(損傷)］/［A510nm(未損傷)－A510nm(損傷)］×100%

經(jīng)全波長(zhǎng)掃描(圖2)發(fā)現(xiàn)，最大吸收波長(zhǎng)為510nm，故選取510nm處進(jìn)行抗氧化測(cè)定。

圖2 鄰二氮菲－金屬鐵離子－H2O2體系全波長(zhǎng)掃描

2 結(jié)果與分析

2.1 麥冬多糖紫外吸收光譜掃描及蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)不同功率提取的麥冬多糖的水溶液在190～400nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，在198nm處有多糖特征吸收峰，在260～280nm范圍內(nèi)無明顯吸收峰，證明麥冬多糖中不含有蛋白質(zhì)和核酸。

2.2 超聲功率對(duì)麥冬多糖提取率及總多糖含量的影響

用五種不同功率超聲提取得到的麥冬多糖均為白色粉末，有清香味，比較疏松，能溶于水，且溶解度較大。經(jīng)80、240、400、560、720W超聲提取得到的麥冬多糖分別占脫脂后麥冬粉末的13.49%、10.65%、9.4%、5.27%、9.8%。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)麥冬多糖中總糖含量分別為88%、82%、80%、77%、84%。若以脫脂后的麥冬粉末作為原料干重，那么這五種功率超聲提取得到的麥冬多糖的提取率分別為11.87%、8.74%、7.5%、4.06%、8.23%(如圖3)。結(jié)果表明，超聲提取麥冬多糖的提取率隨超聲功率的增加先減小后增大。張婭芳［13］用熱水浸提法在最佳工藝條件下得到的麥冬多糖的提取率僅為5.62%。與張婭芳等人的研究工作相比，超聲提取得到的麥冬多糖的提取率明顯高于水提的，這說明超聲功率對(duì)麥冬多糖的提取率有明顯的影響。

圖3 麥冬多糖的提取率

2.3 超聲功率對(duì)麥冬多糖體外清除羥基自由基作用的影響

本實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除效果為參考，檢測(cè)了五種不同功率超聲提取的麥冬多糖對(duì)羥自由基的清除率，如圖4所示，并與水提麥冬多糖進(jìn)行比較，見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五種不同功率超聲提取得到的麥冬多糖對(duì)鄰二氮菲－金屬鐵離子－H2O2體系產(chǎn)生的羥基自由基均有一定的清除作用，且隨加入量的增加，清除率上升，不同功率得到的麥冬多糖在相同濃度下對(duì)羥基自由基的清除率有所不同，其中，560W得到的麥冬多糖的清除率較高，80W較低。從表1可以看出，水提麥冬多糖對(duì)羥基自由基的清除作用明顯高于超聲提取的麥冬多糖，這是一個(gè)十分有趣的問題，值得進(jìn)一步研究。

圖4 麥冬多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

3 討論

3.1 超聲提取麥冬多糖的提取率明顯比傳統(tǒng)水提的高，這可能是由于超聲以其獨(dú)特的力學(xué)效應(yīng)(如攪拌作用、分散效應(yīng)、破碎作用、除氣作用、成霧作用、凝聚作用、定向作用)、熱學(xué)效應(yīng)(如媒質(zhì)吸收熱引起的整體加熱、邊界處的局部高溫高壓等)及空化等物理化學(xué)效應(yīng)［14］會(huì)對(duì)麥冬藥材的細(xì)胞造成一定破壞，促使其中的有效成分更多更快地轉(zhuǎn)移至溶媒中［7］，顯著提高麥冬藥材中多糖的溶出率，縮短提取時(shí)間。

3.2 不同功率超聲提取的麥冬多糖的提取率有所差異，隨著功率的增大，提取率先逐漸減小，然后增大，這可能是由于隨著超聲功率的增大，大分子多糖降解使得提取率降低;當(dāng)功率達(dá)到某個(gè)臨界值時(shí)，隨著功率繼續(xù)增大，提取率又繼續(xù)增大，這可能是由于超聲的巨大能量會(huì)將更大分子量的多糖提取出來所致，這是一個(gè)有趣的問題，值得深入研究。

表1 麥冬多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

3.3 超聲提取的麥冬多糖具有清除羥自由基的作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。柳紅［12］等曾報(bào)道，超聲提取的南瓜多糖比熱水提取的南瓜多糖具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的作用。而對(duì)于麥冬，與傳統(tǒng)水提法相比，超聲提取的麥冬多糖清除羥自由基的活性比較低，這可能是由于超聲波的作用對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。

3.4 不同功率提取的麥冬多糖對(duì)羥自由基的清除率不同，隨著超聲功率的增大，清除率先逐漸增大，然后減小，在超聲功率為560W時(shí)，其抗氧化活性最高。超聲功率太大或太小，其抗氧化能力均較弱，這可能是由于隨著功率的增大，抗氧化活性比較高的多糖被提取出來，或者將大分子量多糖打斷，使其具有抗氧化活性的殘基暴露出來;而超聲功率超過某個(gè)臨界值，繼續(xù)增大，超聲的巨大能量可能會(huì)破壞多糖的活性部位，或者將有抗氧化活性的多糖鍵打斷變成較小分子而使得活性降低。

超聲提取的麥冬多糖具有一定的清除羥自由基的作用，超聲功率與其提取率及生物活性之間有一定的量效關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)為超聲提取中藥多糖對(duì)超聲功率的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可能為功率超聲從中藥中提取其它有效成分提供參考。

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Effect of ultrasonic power on the scavenging activity of Ophiopogon japonicus polysaccharide against hydroxyl radical

WANG Xiao－mei，XUE Hui－jun，SUN Run－guang*
(College of Physics and Information Technology，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

Ophiopogon japonicus polysaccharide was extracted in five different ultrasonic power，and the five Ophiopogon japonicus polysaccharide were determined by the phenol－sulfuric acid method，the phenanthroline－Fe2+reaction system was used to measure the scavenging activity of the five Ophiopogon japonicus polysaccharide on hydroxyl radical.The results indicated that with the ultrasonic power increasing，the extraction of Ophiopogon japonicus polysaccharide decreased first，then increased，and the five Ophiopogon japonicus polysaccharide could remove hydroxyl radical，with the increasing of Ophiopogon japonicus polysaccharide contents，the scavenging actions increased，with the increasing of ultrasonic power，the scavenging actions increased first，then decreased，the scavenging action was the highest when the ultrasonic power was 560W.

Ophiopogon japonicus polysaccharide;ultrasonic power;extraction rate;hydroxyl radical

TS210.1

A

1002－0306(2011)04－0072－04

2009－12－22 *通訊聯(lián)系人

王小梅(1983－)，女，碩士研究生，主要從事分子生物物理的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(10874108);陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(SJ08A16)資助。