乳香提取物對HL-60細胞株VEGF分泌及其Flt-1受體表達的影響

張 勇 ，齊振華 ，李樂賽 ，符曉華 ，彭小寧，張 娜 ，于才紅

（1.中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410013；3.中南大學湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013）

乳香作為橄欖科植物卡氏乳香樹脂，中藥乳香能活血行氣、通經(jīng)止痛、消腫生肌。主治心腹疼痛、風濕痹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌打淤痛、癰疽腫毒等。乳香作為一種應(yīng)用廣泛的植物藥，在我國和印度都有廣泛的應(yīng)用[1]。20世紀中后期，自Tschirch和Halbey等第一次從Boswellic carterii乳香中分離到α和β乳香酸的混合物以來，國內(nèi)外學者便開始了乳香酸類化合物的抗腫瘤活性研究[2-3]。本實驗擬探討乳香提取物對急性早幼粒性白血病HL-60細胞增殖的作用及分泌蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞為本室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。RT-PCR試劑盒均購自華美生物工程公司，引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成純化。兔抗人VEGF、Flt-1多克隆抗體購自美國Santa cruz公司。乳香提取物為中南大學湘雅醫(yī)院藥劑科制備。

1.2 細胞培養(yǎng)

將HL-60細胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，于 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代一次。取對數(shù)生長期的細胞，細胞懸液終濃度調(diào)整為(4～6)×106/mL，分別以不同濃度藥物作用不同時間，以不加藥物的培養(yǎng)細胞為空白對照，并設(shè)溶劑對照(培養(yǎng)基)。收集各時相細胞5×106個，離心棄去上清，加入1 mL Trizol(Gibco公司產(chǎn)品)試劑懸浮細胞，移入1.5 mL EP管中，-40℃保存，待抽提總RNA。

1.3 MTT試驗檢測乳香提取物對白血病細胞體外增殖的影響

HL-60細胞以5×104/mL濃度接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔 200 μL。 于 37℃，5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜。每組設(shè)3個復(fù)孔，胎牛血清濃度2%，加入不同濃度乳香提取物，濃度梯度分別為2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15.0 mg/L。 分別于 24、48、72 h 加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)。棄去上清后加入150 μL二甲亞砜，37℃避光搖動10 min使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀570 nm處測各孔OD值，同時設(shè)調(diào)零孔(培養(yǎng)液,MTT,DMSO)，對照孔(不加乳香提取物,細胞,培養(yǎng)液,MTT,DMSO)。細胞增殖率按(處理組D570/空白組D570)×100%公式計算。 根據(jù)OD值計算乳香提取物作用HL-60細胞的抑制率(CI,%)=(OD對照-OD實驗)/(OD對照)×100%。

1.4 RT-PCR法檢測HL-60細胞VEGF mRNA及受體Flt-1 mRNA的表達

1.4.1 細胞總RNA提取

取對數(shù)生長期細胞，細胞密度為5×106/瓶，設(shè)置對照組及實驗組。根據(jù)MTT實驗的結(jié)果，對照組不加乳香提取物，實驗組選取乳香提取物的濃度分別為2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15.0 mg/L 作用 48 h 后檢測對VEGF-mRNA表達的影響，各組均重復(fù)3瓶。用Trizol提取細胞總RNA，加適量的DEPC水溶解。用1.5%瓊脂糖電泳鑒定RNA的純度并觀察其降解情況，并用DNA/RNA紫外分光光度儀測定其含量。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書[4]進行。取2 μg RNA溶于 11 μL DEPC 水中，加入 oligo(dT)181μL，70℃反應(yīng)5 min后置冰中冷卻，再加入5×RT Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，RNasin 0.5 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，DEPC 水補足 25 μL 體積，37℃反應(yīng) 60 min，cDNA 置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR

引物設(shè)計參考文獻[4]，VEGF引物序列上游為5'-TCG GGC CTC CGA AAC CAT GA-3'，下游為5'-CCT GGT GAG AGA TCT GGT TC-3'。 VEGF引物可用來擴增所有的VEGF包括516 bp，588 bp，648 bp，720 bp大小的同型體。β-actin引物序列：上游引物：5'-CGC TGC GCT GGT CGT CGA CA-3'，下游引物：5'-GTC ACG CAC GAT TTC CCG CT-3'；擴增產(chǎn)物619 bp。引物由上海生工生物工程公司合成、純化。VEGF的 PCR 體系 25 μL包括 10×Mg-Free Buffer 2.5 μL， 2 mmol/L 4×dNTP 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL， 10 pmmol/L 引物各 1.5 μL，Taq 酶 1.5 U，cDNA 2 μL。 置 PCR擴增儀 (GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems)上擴增。VEGF的PCR條件為95℃預(yù)變性5 min，然后變性、退火、延伸分別為94℃ 1 min，60℃ 2 min，72℃ 3 min， 循環(huán) 35 次后，72℃延伸10 min。實驗中分別設(shè)立空白對照(不加模板cDNA)及各樣本的β-actin對照。半定量RT-PCR擴增產(chǎn)物的定量分析：取5 μL擴增產(chǎn)物以含0.5 mg/L溴化已錠(EB)的2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀分析圖像，讀取各條產(chǎn)物帶的光密度值，VEGF-mRNA表達相對值=VEGF光密度值/β-actin光密度值。

1.5 Western Blot檢測乳香提取物對細胞VEGF及Flt-1蛋白表達

取對數(shù)生長期的細胞，細胞密度為5×106/瓶，分組同RT-PCR，各組均重復(fù)3瓶。常規(guī)收集細胞，離心后用IP裂解液提取蛋白。將提取的蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學發(fā)光反應(yīng)、顯影和定影，最后將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白的分子量和凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計學分析

用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。兩組間差別顯著性檢驗進行方差分析、t檢驗分析及Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳香提取物對HL-60細胞增殖的影響

乳香提取物在一定范圍內(nèi)能抑制HL-60細胞增殖，抑制率見圖1。隨著乳香提取物濃度的增加及作用時間的延長，對HL-60細胞抑制作用明顯增強，表現(xiàn)為其抑制率逐漸增高，而以15.0 mg/L組作用48 h抑制率最高。不同濃度組作用48 h后對HL-60細胞抑制率各組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 不同濃度乳香提取物對HL-60細胞作用不同時間抑制率的比較

2.2 乳香提取物處理HL-60細胞前后VEGF-mRNA的表達

對HL-60細胞提取純化的RNA用紫外分光光度儀檢測，結(jié)果A260和A280的比值均在1.9～2.1范圍，證明無蛋白質(zhì)污染。半定量RT-PCR結(jié)果，如圖2。乳香提取物15.0 mg/L組作用48 h對HL-60細胞VEGF-mRNA表達抑制顯著，處理前后測得VEGF-mRNA相對值統(tǒng)計學分析均有差異(P＜0.05)。

圖2 RT-PCR分析VEGF-mRNA表達結(jié)果

2.3 乳香提取物處理HL-60細胞前后VEGF、flt-1蛋白的表達

Western Blot結(jié)果見表1，顯示乳香提取物15.0 mg/L濃度組能抑制HL-60細胞VEGF及Flt-1蛋白表達，與處理前VEGF及受體FLT-1蛋白光密度值比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HL-60細胞VEGF與Flt-1蛋白表達具有相關(guān)性(r=0.895，P=0.021）。

表1 乳香提取物對急性白血病細胞株HL-60細胞VEGF及FLt-1表達的影響(光密度值)

3 討論

乳香作為一種傳統(tǒng)中藥，一直以來用于治療關(guān)節(jié)疼痛等病癥。近年來乳香抗腫瘤作用引起了較為廣泛的關(guān)注,其作用已經(jīng)在前列腺腫瘤、膀胱癌[5]等研究中得到證實。乳香提取物是一組天然化合物的混合物,其成分較為復(fù)雜，主要成分為α乳香酸和β乳香酸。在對乳香提取物抗白血病作用的研究中,我們的前期研究也證實了乳香具有誘導(dǎo)急性髓細胞性白血病細胞凋亡、抑制白血病細胞增殖的作用[6]。我們還發(fā)現(xiàn)低濃度的乳香提取物即可誘導(dǎo)急性髓系白血病HL-60細胞、NB4細胞和急性髓細胞性白血病原代細胞凋亡,其凋亡率遠遠高于同等干預(yù)條件下急性淋巴細胞白血病細胞(ALL)，提示乳香抗白血病作用的特異性，其分子機制有待于進一步探討研究[7]。

血管新生(angiogenesis)是指在已經(jīng)存在的血管的基礎(chǔ)上以出芽方式形成新的微血管的過程，可見于胚胎發(fā)育期及出生后，是胚胎發(fā)育和傷口愈合等生理過程中的一個基本因素，但在惡性轉(zhuǎn)化過程中新生血管調(diào)控紊亂導(dǎo)致腫瘤相關(guān)毛細血管網(wǎng)的形成，進而刺激腫瘤細胞的存活和增殖。1971年Folkman[8]報導(dǎo)腫瘤在2 mm3大小時，為進一步生長啟動新血管生成，因此抑制血管新生可以阻斷腫瘤進展[9]。血管新生在實體瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，越來越多的證據(jù)顯示，白血病也是一種血管新生依賴的腫瘤[10]，抗血管新生已成為白血病治療的第二靶點。

血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的強有力的微血管新生誘導(dǎo)劑，是一種典型的外分泌蛋白，選擇性直接作用于血管內(nèi)皮細胞膜上的受體酪氨酸激酶，激活細胞信號通路，促進多種微血管新生所需事件[11]。Aguayo[12]等分析了99例急性髓細胞白血病(AML)患者骨髓血和白血病細胞胞漿中VEGF的含量，結(jié)果患者骨髓血VEGF含量顯著升高，其水平與患者胞漿VEGF水平呈現(xiàn)正相關(guān)。VEGF經(jīng)典的受體主要是兩類結(jié)構(gòu)類似的受體酪氨酸激酶(RTKs)即VEGFR-1(Flt-1）和VEGFR-2(KDR)。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)急性白血病患者體內(nèi)VEGF受體KDR水平較正常人顯著升高[13]，血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑是一種有前途的癌癥治療藥物[14]。

本研究應(yīng)用不同濃度乳香提取物作用于HL-60細胞,并且在實驗中設(shè)立用DMSO作用的對照組,排除了DMSO細胞毒作用的影響,保證了實驗的可比性。不同濃度乳香提取物作用于HL-60細胞后,細胞生長受到抑制(P＜0.05)，且乳香提取物濃度增加時，細胞的抑制率也隨之增加。實驗中同時檢測培養(yǎng)細胞上清中VEGF濃度的變化，結(jié)果顯示HL-60細胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度隨著乳香提取物濃度的增加而降低，隨著作用時間延長亦降低，這提示乳香提取物可以抑制HL-60細胞分泌VEGF，呈濃度時間依賴性。RT-PCR檢測結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)VEGF-mRNA及VEGF受體1(FLt-1)-mRNA的表達降低亦與乳香提取物成劑量時間依賴關(guān)系。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)乳香提取物作用后HL-60內(nèi)VEGF蛋白及受體FLT-1蛋白的表達與其mRNA表達一致。因此，我們推斷乳香提取物可能通過抑制HL-60細胞表達VEGF及其受體Flt-1，發(fā)揮抗血管新生成作用。

綜上所述，乳香提取物能抑制HL-60細胞VEGF及其受體Flt-1的表達，其作用呈一定的劑量和時間依賴性，在急性髓細胞性白血病治療領(lǐng)域具有良好臨床應(yīng)用前景。我們的實驗進一步了解乳香抗白血病的藥理作用機制，為充分開發(fā)利用中藥提出了新的研究思路，亦為白血病治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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