植物液泡膜陽離子/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進展

張玉秀，彭曉靜，柴團耀，張春玲，劉金光

1 中國礦業(yè)大學(xué) (北京) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院研究生院 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

3 河北維爾康制藥有限公司，石家莊 050031

植物液泡膜陽離子/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進展

張玉秀1，彭曉靜1，柴團耀2，張春玲3，劉金光1

1 中國礦業(yè)大學(xué) (北京) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院研究生院 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

3 河北維爾康制藥有限公司，石家莊 050031

陽離子轉(zhuǎn)運蛋白在調(diào)節(jié)細胞質(zhì)陽離子濃度過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。液泡是一個儲存多種離子的重要細胞器，陽離子 (Ca2+)/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白CAXs定位在液泡膜上，主要參與Ca2+向液泡的轉(zhuǎn)運，也參與其他陽離子的轉(zhuǎn)運。近年來，植物中分離鑒定了多個CAX基因，植物CAXs主要有4個功能域：NRR通過自抑制機制調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運活性，CaD和C功能域分別賦予CAXs的Ca2+和Mn2+專一性轉(zhuǎn)運活性，D功能域可調(diào)節(jié)細胞質(zhì)pH。擬南芥AtCAXs參與植物的生長發(fā)育和脅迫適應(yīng)過程，AtCAX3主要在鹽脅迫下轉(zhuǎn)運Ca2+，AtCAX2和AtCAX4在重金屬脅迫下參與重金屬離子 (Cd2+、Zn2+和Mn2+) 的轉(zhuǎn)運和解毒過程，表明CAXs基因在強化植物營養(yǎng)和提高植物修復(fù)潛力方面有重要作用。以下主要綜述植物CAXs的分類、結(jié)構(gòu)及功能方面的研究進展。

CAXs，結(jié)構(gòu)，功能，重金屬

Abstract:Cation transporters play important roles in modulating the concentration of intracellular metal ions. The vacuole is an important storage organelle for many ions. Cation (Ca2+)/H+antiporters (CAXs) located at vacuolar membrane are mainly involved in the Ca2+flux into the vacuole, and appear to be capable of transporting various divalent cations to some degree.Several CAX genes have been isolated and characterized from various plants in recent years. Four domains of plant CAXs have been identified: NRR regulates Ca2+transport by a mechanism of N-terminal autoinhibition; Ca domain and C domain confer Ca2+and Mn2+specificity among CAX transporters, respectively; D domain plays a part in the regulation of cytosolic pH. AtCAXs identified in Arabidopsis thaliana are involved in the growth, development and stress adaption of plant. AtCAX3 is the mainly Ca2+/H+transporter in response to salt stress; AtCAX2 and AtCAX4 participate in transportation and detoxicification of heavy metal ions (Cd2+, Zn2+, and Mn2+) in cells under heavy metal stress, and impact root/shoot Cd partitioning in plant. These suggest that CAX genes may be useful for nutritional enhancement of plants, and for increasing phytoremediation potential. Here, the classification, structure and function of CAXs in plants are reviewed.

Keywords:CAXs, structure, function, heavy metal

Ca2+是細胞結(jié)構(gòu)組分，又是多種酶的輔助因子和許多細胞代謝過程的信使分子。細胞質(zhì)中的 Ca2+是植物生理代謝的樞紐，其濃度的變化參與調(diào)節(jié)植物生長和對環(huán)境的適應(yīng)性過程。Ca2+缺乏導(dǎo)致植株葉片壞疽，產(chǎn)量降低，甚至死亡；相反，Ca2+濃度過高，胞內(nèi)Ca2+平衡破壞，引起Ca2+中毒，磷代謝受到干擾。植物細胞內(nèi)存在精細的 Ca2+濃度調(diào)節(jié)機制，既能使細胞質(zhì)中游離Ca2+濃度迅速升高以響應(yīng)環(huán)境變化，又能使其維持基礎(chǔ)條件下的低濃度，這種精細的調(diào)節(jié)機制主要是通過體內(nèi) Ca2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)實現(xiàn)的。Ca2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)包括Ca2+通道、Ca2+-ATPase (Ca泵) 和 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白 (Cation (Ca2+)/H+antiporter) 等，Cation (Ca2+)/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白又稱為陽離子交換器 (Cation (Ca2+)/H+exchanger，CAXs)。液泡是細胞存儲 Ca2+的主要細胞器，Ca2+的Ca2+-ATPase和具有高效轉(zhuǎn)運能力的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白均定位在液泡膜上，通過水解ATP供能可將細胞質(zhì) Ca2+轉(zhuǎn)運到液泡中，從而可部分地調(diào)控細胞質(zhì)的 Ca2+水平[1]。

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白 (VCX1) 屬于 CAX家族，負責(zé)向液泡轉(zhuǎn)運Ca2+；酵母突變株K667液泡缺失Ca2+-ATPase(PMC1) 和VCX1，因此表現(xiàn)Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，對Ca2+敏感性增強，不能在高濃度Ca2+(≥100 mmol/L) 培養(yǎng)基中生長[2]。模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana的AtCAX1和AtCAX2可抑制酵母突變株K667的Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，是首次被鑒定的植物CAX家族蛋白[3]。CAX廣泛存在于古生菌、細菌和真核生物[4]。植物CAXs定位于液泡膜，由質(zhì)子泵H+-ATPase或H+焦磷酸酶 (Pyrophosphatase) 形成的pH梯度驅(qū)動將細胞質(zhì)中的多種金屬陽離子輸入到液泡中，使胞質(zhì)的金屬離子維持在合適的濃度范圍[3,5]。目前，已鑒定了多種植物CAX基因，如擬南芥AtCAX1-6、水稻Oryza sativa的OsCAX1-4、綠豆Vigna radiate的VCAX1、玉米Zea may的ZmHCX1和ZmCAX2、大豆Glycine max的GmCAX1和綠藻Chlamydomonas reinhardtii的 CrCAX1-2等，多數(shù)研究主要集中在AtCAX1-4。植物 CAXs除具有 Ca2+反向轉(zhuǎn)運活性外，還能轉(zhuǎn)運其他金屬離子，如 AtCAX2可轉(zhuǎn)運Mn2+和 Cd2+，CrCAX1 和 AtCAX4 能轉(zhuǎn)運 Cd2+等[6-8]。過量表達 CAXs可提高植株的 Ca2+、Cd2+或 Mn2+等金屬離子耐受性和累積能力[2,9-10]。

土壤重金屬污染，尤其是Cd、Mn和Pb污染問題日益嚴重，重金屬不僅能毒害植物，導(dǎo)致生理代謝紊亂，產(chǎn)量和品質(zhì)降低[1,11]，而且能通過食物鏈的富集作用威脅人類的健康。重金屬累積植物可通過吸收和累積重金屬清除土壤中的重金屬離子，其中重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在重金屬離子的吸收、轉(zhuǎn)運和解毒方面發(fā)揮重要作用。CAXs可轉(zhuǎn)運重金屬 Mn和Cd[7-8]，為提高植物的重金屬耐受性、增強土壤重金屬污染的植物修復(fù)能力和強化食物營養(yǎng)元素帶來了曙光。近年來，植物 CAXs的結(jié)構(gòu)、功能和金屬離子轉(zhuǎn)運特性等研究取得了很大進展。本文主要綜述了植物 CAXs的分類、結(jié)構(gòu)、功能及其在重金屬累積植物中作用的研究進展。

1 植物CAXs的分類和在細胞組織中的分布

1.1 植物CAXs的分類

生物體中有多個CAX，為了研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，根據(jù) CAXs的序列和結(jié)構(gòu)相似性對其進行歸類分析。利用來源于細菌、真菌、植物、低等脊椎動物 (魚和兩棲動物) 的138個全長的CAX序列構(gòu)建進化樹，分析表明CAXs可分為3個類型，其中 I型 CAXs包括植物以及部分真菌和細菌的CAXs，I型CAXs又可分為8個亞型 (A-G)。雖然不同進化分枝的保守氨基酸重復(fù)序列 (c-repeat) 略有不同，但 A亞型 CAXs的第 4跨膜功能域(Transmembrane domain 4，TM4) 后面均含有高親水氨基酸區(qū)域，其中含有多個帶正電荷的氨基酸殘基，與TM6和TM7之間的酸性氨基酸基序不同[12]。我們在GenBank中搜索了來源于水稻、擬南芥、玉米、綠豆、綠藻以及酵母等的17個CAXs的氨基酸序列，ClustalX2分析顯示 (圖 1)，CAXs分為4個進化分支，酵母VCX1和綠藻CrCAX分別為獨立的F亞型和C亞型，高等植物擬南芥、水稻、玉米和綠豆等CAXs形成另外兩大進化分支：A亞型和B亞型，其中擬南芥 (AtCAX1、AtCAX3和AtCAX4)、水稻(OsCAX1a、OsCAX1b 和 OsCAX1c)、綠豆 (VCAX1)和玉米 (ZmHCX1) 屬于 A亞型；而擬南芥AtCAX2、AtCAX5和 AtCAX6與水稻 OsCAX2、OsCAX3和OsCAX4屬于B亞型，與Shigaki等[12]的分類結(jié)果相似。在A亞型CAXs中，雙子葉植物綠豆VCAX1與擬南芥AtCAX1的序列一致性為68%；禾本科單子葉植物玉米ZmHCX1與水稻 OsCAX1b序列一致性為 77%；而單子葉植物 OsCAX1a、OsCAX1b、OsCAX1c和 ZmHCX1與雙子葉植物AtCAX1的序列一致性分別為63%、62%、57%和64%，表明雙子葉植物和單子葉植物的 CAXs差異性較大。A亞型中的AtCAX1主要參與Ca2+轉(zhuǎn)運，而AtCAX3和AtCAX4分別參與鹽脅迫和Cd2+轉(zhuǎn)運的。在 B亞型 CAXs中，AtCAX5和 AtCAX6與AtCAX2的一致性分別為87%和82%，OsCAX2、OsCAX3和OsCAX4與AtCAX2的序列一致性均高達 70%。擬南芥 AtCAX2的 CAF氨基酸殘基賦予其Mn2+轉(zhuǎn)運特性，而AtCAX5和AtCAX6也均含有CAF殘基，推測二者可能也參與Mn2+轉(zhuǎn)運[13]，所以這3個CAX同歸為B亞型。盡管水稻OsCAX2、OsCAX3和OsCAX4與AtCAX2的氨基酸序列一致性較高，但其轉(zhuǎn)運特性未見報道。綠藻CrCAX1和CrCAX2與酵母Ca2+轉(zhuǎn)運VCX1的序列一致性分別為43%和42%，然而CrCAX1同時具有Ca2+和Na+轉(zhuǎn)運作用[6]。從進化樹分析得知 CAXs是一種進化上保守的蛋白質(zhì)，主要參與 Ca2+轉(zhuǎn)運，同時也可轉(zhuǎn)運其他多種金屬陽離子。

圖1 植物CAXs的分類Fig. 1 Classification of CAXs in plants.

1.2 CAXs在植物組織器官中的表達和定位

AtCAX1是細胞內(nèi) Ca2+水平的重要調(diào)節(jié)器[1]。AtCAX1-GUS (β-glucoronidase) 融 合 表 達 顯 示AtCAX1主要在葉片、花組織、以及子葉和幼葉的維管細胞中表達，在根、莖表達較少；全長的AtCAX1(Long AtCAX) 和缺失 N-端調(diào)節(jié)區(qū) (N-terminal regulatory region，NRR) 36個氨基酸 (aa) 的AtCAX1(short AtCAX，sAtCAX) 在50 mmol/L CaCl2時均可抑制酵母突變株 K667對 Ca2+的敏感性[14]，且表達sAtCAX1的轉(zhuǎn)基因煙草液泡的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性增加[1]。紅細胞凝集素 (Hemagglutinin，HA) 標記的全長的 AtCAX1 (HA-AtCAX1) 和 NRR缺失的sAtCAX1 (HA-sAtCAX1) 在酵母中異源表達，蛋白質(zhì)印跡 (Western blotting) 分析表明 AtCAX1和sAtCAX1均定位在酵母的液泡膜上[15]。免疫分析也進一步證實HA-sAtCAX1和AtCAX1均定位于擬南芥和煙草的液泡膜，排除了AtCAX1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體的可能性[16]。綠藻 CrCAX1-GFP (Green fluorescent protein，GFP) 和 sCrCAX1-GFP融合表達顯示CrCAX1定位于液泡膜上[6]。表明 CAX1定位于液泡膜上，具有向液泡轉(zhuǎn)運Ca2+作用，且NRR不影響其定位。

Northern雜交表明在擬南芥所有組織中的AtCAX2 mRNA水平均低于AtCAX1[9]。AtCAX2-GUS融合表達表明AtCAX2主要在10 d苗齡擬南芥的葉片維管組織、頂端分生組織、根部維管組織及根尖表達；在30 d的幼苗中，AtCAX2主要在葉柄、葉片維管組織、葉片水孔 (Leaf hydathodes) 及花組織中表達[7]。蛋白質(zhì)印跡分析顯示 AtCAX2定位于野生型擬南芥的液泡膜[9]。AtCAX3與AtCAX1的序列一致性為 78%，然而，AtCAX3主要在根部表達，尤其是根尖，而在葉片及莖組織中很少，幼花芽和花中也觀察到 AtCAX3的表達[14]，表明 AtCAX1和AtCAX3表達的組織部位特異性不同。免疫印跡分析顯示HA-AtCAX3在擬南芥和煙草的液泡膜表達，而不是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[14]，與AtCAX1在細胞中的定位序列一致。AtCAX4與AtCAX1、AtCAX2和AtCAX3的一致性分別為 53%、42%和 54%，AtCAX4的mRNA水平很低，在所有組織中都檢測不到，但幼苗經(jīng) Mn2+、Na+或 Ni+處理后其 mRNA水平提高。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示 HA-AtCAX4定位于酵母液泡膜；煙草懸浮細胞免疫顯色結(jié)果顯示與 HA抗體和二級抗體德克薩斯紅 (Texas red) 結(jié)合的HA-AtCAX4在液泡膜上生成紅色熒光信號，表明AtCAX4也定位于液泡膜[8]。

2 CAXs的結(jié)構(gòu)和功能域

CAXs是跨膜蛋白 (圖 2)，酵母和植物 CAXs有11個TM，N-端位于細胞質(zhì)，C-端位于液泡中。TM6和TM7之間的一個酸性氨基酸基序?qū)AX分成大約相等的兩部分；TM3與TM4、TM8與TM9之間均含有與離子轉(zhuǎn)運專一性有關(guān)的兩個保守氨基酸重復(fù)序列 (c-1和c-2)[12,17]。CAXs有4個典型的功能域 (圖 2)：N-末端自抑制區(qū)域 NRR、Ca2+功能域 (CaD)、C功能域和D功能域，并確定了起作用的關(guān)鍵氨基酸。NRR調(diào)控CAXs的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性，且只有在 N-端的依賴調(diào)節(jié)區(qū)域 (Regulationdependent region，RDR) 存在時才能抑制 AtCAX1的Ca2+轉(zhuǎn)運活性[15,18-19]，CaD決定CAXs的 Ca2+轉(zhuǎn)運能力[20]，C功能域與AtCAX2的Mn2+專一性轉(zhuǎn)運相關(guān)[13]，D功能域調(diào)節(jié)胞質(zhì)的pH[21]。

圖2 CAXs的拓撲結(jié)構(gòu)Fig. 2 Topology model of CAXs.

2.1 NRR功能域

AtCAX1的 NRR功能域調(diào)節(jié)其 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性。表達序列標簽 (Expressed sequence tag，EST) 分析表明AtCAX1的N-端比VCX1多36 aa，命名為N1-36或NRR (圖2)。AtCAX1在液泡膜的定位與NRR無關(guān)[6,14-15]。sAtCAX1可抑制酵母突變株 K667對高濃度 Ca2+的敏感性，而全長 AtCAX1無此功能，說明 NRR可通過 N-末端自抑制機制調(diào)節(jié)AtCAX1的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性[15]。

合成肽AtCAX1-NRR與AtCAX1的NRR序列一致，可專一性地抑制sAtCAX1的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性，卻不能抑制 sAtCAX2、VCX1和sAtCAX3-9的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性，說明NRR功能域的抑制作用具有專一性。將sAtCAX1的前1/4區(qū)域 (37-149 aa，A區(qū)域) 融入到sAtCAX3的閱讀框中，獲得sAtCAX3-A融合肽，其Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性可被AtCAX1-NRR抑制；含有CaD (9 aa，位于A區(qū)域的后半段) 的sAtCAX1反向轉(zhuǎn)運活性可被AtCAX1-NRR抑制；然而，AtCAX1的CaD分別與sAtCAX3和 sAtCAX2融合得到 sAtCAX3-9和sAtCAX2-9融合肽，其反向轉(zhuǎn)運活性不受AtCAX1-NRR影響，說明與 NRR相互作用的區(qū)域位于A區(qū)域的前半段，而非CaD。將sAtCAX1的A區(qū)域進一步分成A1 (37-73 aa) 和A2 (74-149 aa) 兩個區(qū)域，AtCAX1-NRR不能抑制融合肽sAtCAX3-A2 (sAtCAX1的A2取代sAtCAX3相應(yīng)的區(qū)域) 和 sAtCAX1-A1 (sAtCAX3的 A1取代sAtCAX1相應(yīng)的區(qū)域) 的Ca2+反向轉(zhuǎn)運活性，表明A1區(qū)域是AtCAX1-NRR抑制AtCAX1反向轉(zhuǎn)運活性的關(guān)鍵區(qū)域[18]。

AtCAX1中的NRR與RDR相互作用可調(diào)節(jié)其Ca2+轉(zhuǎn)運活性 (圖 3)。氨基酸序列比對分析表明AtCAX1的A1有V50I51和Y56K57G58L59K60D61F62(7 aa) 2個異質(zhì)性區(qū)域，其序列與AtCAX3的A1區(qū)域不同。將sAtCAX3-9 (含有AtCAX1 CaD的9 aa)和sAtCAX1-A1的L50V51定點突變?yōu)锳tCAX1的A1的 V50I51后，兩種突變蛋白均可轉(zhuǎn)運 Ca2+，但其反向轉(zhuǎn)運活性不受 AtCAX1-NRR的影響。將sAtCAX3-9和sAtCAX1-A1的C56K57T58L59K60N61I62定點突變?yōu)锳tCAX1的A1中的Y56K57G58L59K60D61F62序列，突變的 sAtCAX3-9-7aa和 sAtCAX1-A1-7aa均有Ca2+轉(zhuǎn)運活性，且能被AtCAX1-NRR抑制，說明A1的7 aa序列是NRR抑制AtCAX1反向轉(zhuǎn)運活性的關(guān)鍵氨基酸。AtCAX1的7 aa序列被AtCAX3的取代后 (AtCAX1-7aa)，可以抑制酵母突變株K667的 Ca2+敏感性，但其活性低于 sAtCAX1；sAtCAX1的 7 aa序列被 AtCAX3的 7 aa取代后(sAtCAX1-7 aa)，其抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性與sAtCAX1的活性一致，但其反向轉(zhuǎn)運活性不受AtCAX1-NRR的影響。這些結(jié)果表明RDR的7 aa殘基 Y56K57G58L59K60D61F62是 AtCAX1自抑制發(fā)生所必需的，即只有 RDR存在時，AtCAX1-NRR才能抑制 Ca2+的轉(zhuǎn)運。酵母雙雜交系統(tǒng) (Yeast two-hybrid assay) 分析顯示 (圖3) NRR的5個氨基酸殘基 Ser25、Arg26、Arg29、Arg32和 Thr33在與 RDR相互作用中發(fā)揮重要作用。當受刺激時，AtCAX1的NRR構(gòu)象發(fā)生變化，可阻止NRR與RDR的相互作用，從而激活A(yù)tCAX1的反向轉(zhuǎn)運活性；NRR缺失時 (sAtCAX1)，蛋白質(zhì)從 Met37開始翻譯，不能與RDR相互作用，致使反向轉(zhuǎn)運蛋白sAtCAX1一直處于活化狀態(tài)[18]。

圖3 NRR調(diào)節(jié)AtCAX1的模型[18]Fig. 3 Model of CAX1 regulation by the NRR[18].

NRR的磷酸化參與調(diào)節(jié)AtCAX1的Ca2+反向轉(zhuǎn)運活性。AtCAX1的NRR有5個可能的磷酸化位點，如 Thr6、Ser10、Ser24、Ser25和 Thr33，這些氨基酸的定點突變可以抑制其磷酸化作用，導(dǎo)致AtCAX1失活。將這5個氨基酸分別定點突變?yōu)锳la (A)，突變株分析表明只有T33A (Thr定點突變?yōu)锳la) 突變的AtCAX1可以強烈抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性，說明Thr33的磷酸化可降低K667突變株對Ca2+敏感性。進一步將Thr33定點突變?yōu)锳sp (T33D) (模擬連續(xù)磷酸化) 以及T33S和T33E，這些突變均可使酵母菌株 K667在高濃度 Ca2+環(huán)境中生長，表明Thr33在自抑制作用中主要受其結(jié)構(gòu)的影響，而非磷酸化作用。S25A突變僅能微弱地抑制K667酵母的Ca2+敏感性，S25T則不能；但模擬連續(xù)磷酸化的S25D突變體與sAtCAX1一致，可以有效抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性。S10D和S24D的突變都不能抑制酵母突變株 K667的 Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷。因此，AtCAX1的Ser25磷酸化可激活其Ca2+轉(zhuǎn)運活性。不帶電荷的Ala取代Arg殘基時，AtCAX1被激活，因此，帶正電荷的Arg殘基也參與自抑制機制[18]。

信號分子 CXIP4 (CAX interacting proteins 4)是擬南芥細胞核蛋白，可調(diào)節(jié) AtCAX1的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性。CXIP4與AtCAX1的NRR結(jié)合，可阻止 AtCAX1自抑制作用，從而激活 AtCAX1的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性。CXIP4基因只存在于植物中，編碼一個由332 aa組成的分子量約為37.8 kDa的多肽，CXIP4富含Arg (15.1%)、Lys (11.1%)、Glu(11.7%) 和 Ser (15.4%)。MotifScan顯示 CXIP4的N-端有一個鋅指基序 (CCHC)，C-端有一富含 Arg的區(qū)域，在酵母中可激活A(yù)tCAX1的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性。研究表明CXIP4或AtCAX1在酵母突變株K667中單一表達均不能抑制其液泡Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，然而，CXIP4+AtCAX1共表達時酵母突變株K667可在 200 mmol/L CaCl2的培養(yǎng)基中生長，其 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性是 sAtCAX1突變株的 10%，表明CXIP4可激活 AtCAX1的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性。CXIP4只能激活 AtCAX1的 Ca2+轉(zhuǎn)運活性，而對AtCAX2、AtCAX3和 AtCAX4無作用，然而，CXIP4能激活含有AtCAX1-NRR的AtCAXs融合體的 Ca2+轉(zhuǎn)運活性，說明 CXIP4與 AtCAX1的相互作用位點位于 NRR功能域。sAtCAX3-A1 N-端的A1區(qū)域來源于 AtCAX1，但 sAtCAX3-A1+CXIP4與 AtCAX1+CXIP4抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性的能力不同；保持有自抑制能力的、NRR突變的AtCAX1和CXIP4共表達時，一些突變可抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性，另一些突變則不能，表明AtCAX1的NRR有多個區(qū)域參與CXIP4的激活作用[22]。

氨基酸序列分析顯示 NRR普遍存在于 CAXs中，VCAX1、AtCAX2、AtCAX3、AtCAX4以及CrCAX1都含有相似的 NRR序列[6,19]，CrCAX1僅能輕微地抑制酵母突變株 K667的 Ca2+敏感性，然而，在 200 mmol/L CaCl2濃度下，sCrCAX1與sAtCAX1一樣能有效抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性[6]。AtCAX1和AtCAX3的NRR的氨基酸序列 (36 aa) 有 24個完全相同，但 AtCAX3和sAtCAX3都不能抑制酵母突變株 K667對高濃度Ca2+的敏感性。AtCAX4也不能抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性，然而，N-端融合體HA-AtCAX4與sAtCAX1一樣，可有效地抑制酵母突變株K667液泡的 Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷。sAtCAX4或融入 AtCAX1 CaD序列的AtCAX4均可輕微地抑制酵母突變株轉(zhuǎn)運Ca2+的缺陷；融入AtCAX1 CaD的sAtCAX4與sAtCAX1活性一樣，能有效抑制酵母突變株Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，表明CAXs可能是通過改變N-端構(gòu)象調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運活性[8]。

CAXs的 NRR精確的調(diào)節(jié)機制存在差異。AtCAX2的N-端有2個Met殘基。N-端缺失前42 aa的sAtCAX2可抑制酵母突變株K667的Ca2+和Mn2+敏感性，N-端缺失前16 aa的sAtCAX2與AtCAX2一樣，不能抑制酵母突變株K667的Mn2+和Ca2+敏感性；而N-端不完整的AtCAX1可抑制酵母突變株K667的 Ca2+敏感性[15]。AtCAX3的 NRR 序列與AtCAX1高度一致，但其調(diào)節(jié)功能與后者存在差異。在50 mmol/L CaCl2培養(yǎng)基中，表達sAtCAX3的酵母突變株與空載體對照株系的生長狀況相似，表達AtCAX3的酵母突變株的生長雖然較差，但優(yōu)于對照株系。AtCAX3的NRR定點突變后能抑制sAtCAX1的Ca2+轉(zhuǎn)運活性。AtCAX3的NRR與sAtCAX1構(gòu)建的融合體3N:sAtCAX1可抑制酵母突變株的Ca2+敏感性，將 A17N18V19定點突變?yōu)?P17S18I19(3N-3:sAtCAX1)，仍可抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性；將His30突變?yōu)長eu (3N-1:sAtCAX1) 則不能抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性。綠豆 VCAX1也有一個長的疏水的N-末端，其NRR與AtCAX1的相似性較低，在31 aa中只有18個相同。VCAX1雖沒有sAtCAX1作用顯著，但也可以抑制酵母突變株K667的 Ca2+敏感性，敲除 N-端前 31 aa的 VCAX1(sVCAX1) 與 sAtCAX1一樣，能有效地抑制 K667的Ca2+敏感性，其活性比全長VCAX1提高了70%。與AtCAX1相比，VCAX1的NRR的C端有3個異質(zhì)性區(qū)域：Pro16之后缺失 SITA，V18L19T20和M23R24H25序列分別取代了 AtCAX1的 G18S19S20和L23R24L25序列。只有將VCAX1 中NRR的M23R24H25定點突變?yōu)?L23R24L25時，VCAX1的 NRR和sAtCAX1融合肽VN:sAtCAX1才不能抑制酵母突變株 K667的 Ca2+敏感性。3N:sAtCAX1和VN:sAtCAX1的定點突變研究表明AtCAX1的Leu30在其自抑制中發(fā)揮重要作用。AtCAX1-L30H (Leu30突變?yōu)镠is) 和 sAtCAX1同樣能有效抑制酵母突變株的Ca2+敏感性。每一種Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)功能域均有特定的作用方式，功能域間的微小差異都會影響其抑制活性，VCAX1和AtCAX1的Ca2+轉(zhuǎn)運活性差異可能是由于N-端自抑制區(qū)域結(jié)合的緊密性不同引起的[19]。

2.2 Ca功能域 (CaD)

AtCAX3與AtCAX1有78%的一致性。AtCAX3和sAtCAX3均不能抑制酵母突變株K667對高濃度Ca2+的敏感性。構(gòu)建的 sAtCAX1和 sAtCAX3融合體呈現(xiàn)不同的 Ca2+轉(zhuǎn)運特性：sAtCAX3-A融合體(sAtCAX1的 N-端融入 sAtCAX3) 在酵母中可轉(zhuǎn)運Ca2+；sAtCAX1-A 融合體 (sAtCAX3的 N-端融入sAtCAX1) 不能抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性；sAtCAX1-β/sAtCAX1-γ 或 sAtCAX1-δ 融 合 體(sAtCAX3的中央或C-端序列融入sAtCAX1) 的Ca2+轉(zhuǎn)運活性與sAtCAX1沒有差異；相反，sAtCAX3-β/sAtCAX3-γ或 sAtCAX3-δ融合體 (sAtCAX1 的中央或 C-端融入 sAtCAX3) 不能抑制酵母突變株 K667液泡的Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，表明N-端區(qū)域決定sAtCAX的Ca2+轉(zhuǎn)運活性差異。將sAtCAX1的N-端分成α1(37-73 aa，即 A1) 和 α2 (74-149 aa，即 A2) 兩部分，sAtCAXA3-A2 (sAtCAX1的 A2融入 sAtCAX3) 融合體可抑制酵母突變株 K667的 Ca2+敏感性；而sAtCAX3-A1 (sAtCAX1的A1融入sAtCAX3) 融合體在含 Ca2+的培養(yǎng)基中生長多天之后才有微弱的抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性作用，因此，sAtCAX1的 A2區(qū)決定了 sAtCAX1和 sAtCAX3 的 Ca2+轉(zhuǎn)運的絕大部分活性差異[20]。

AtCAX1 A2區(qū)域的 9 aa (87-95 aa) 在不同CAXs中變化較大。sAtCAX3-9融合體 (AtCAX1 A2區(qū)域的9 aa融入sAtCAX3) 只能轉(zhuǎn)運Ca2+，其轉(zhuǎn)運能力是sAtCAX1的36.5%，而sAtCAX1既可轉(zhuǎn)運Ca2+，也能轉(zhuǎn)運 Cd2+。sAtCAX2-9 (9 aa融入sAtCAX2) 的Ca2+運轉(zhuǎn)活性是sAtCAX2的2倍，而Cd2+和Mn2+轉(zhuǎn)運能力不變，進一步證實9 aa，即CaD對Ca2+轉(zhuǎn)運的選擇專一性[20]。

融入AtCAX1 CaD前3個氨基酸 (87-89 aa) 的sAtCAX3 (sAtCAX3-3) 可抑制酵母突變株K667液泡Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，但活性變化沒有sAtCAX3-9顯著，在含Ca2+的培養(yǎng)基中生長2 d后才能觀察到明顯菌落；而融入sAtCAX1 中CaD的中間3個 (90-92 aa)或后3個氨基酸 (93-95 aa) 的sAtCAX3不能抑制酵母突變株的Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，表明CaD的前3個氨基酸賦予 sAtCAX3的 Ca2+轉(zhuǎn)運能力。融合表達sAtCAX3-3或sAtCAX3-6 (sAtCAX1中 CaD的前6個氨基酸分別融入sAtCAX3中) 的酵母Ca2+吸收能力是表達 sAtCAX3-9酵母的 60%，sAtCAX3-3和sAtCAX3-6的Ca2+轉(zhuǎn)運能力沒有差異。進一步改變sAtCAX3 CaD的前 3個和后 3個氨基酸，sAtCAX3-3X3 (sAtCAX3 CaD的前3個及后3個氨基酸與sAtCAX1的CaD相應(yīng)的氨基酸序列一致) 不能抑制酵母突變株 K667液泡的 Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，表明sAtCAX1的CaD中間3個氨基酸也是Ca2+轉(zhuǎn)運必不可少的。sAtCAX3中CaD的單個或多個氨基酸突變不能賦予AtCAX3高水平的Ca2+轉(zhuǎn)運能力，推測CaD中的氨基酸可能通過形成特定的結(jié)構(gòu)單元發(fā)揮作用[20]。

AtCAX1中CaD的前3個氨基酸 (87-89 aa) 決定sAtCAX3的Ca2+轉(zhuǎn)運能力。將sAtCAX3的87-89 aa定點突變?yōu)閟AtCAX1相應(yīng)的氨基酸 (L87I、A88C和 N89T)，L87I賦予 sAtCAX3 (sAtCAX3-I) 的 Ca2+轉(zhuǎn)運能力最強，是 sAtCAX1的 7.1%。雖然sAtCAX3-I抑制酵母K667的Ca2+敏感性能力明顯不如sAtCAX3-9，但在Ca2+培養(yǎng)基生長2 d后可明顯看到的突變株K667菌落，推測Ile可能與sAtCAX3跨膜功能域中特定的氨基酸側(cè)鏈相互作用，協(xié)助Ca2+或H+配位。當sAtCAX3的L87突變?yōu)樘囟ǖ闹咀寤蛑行园被釙r，如 sAtCAX3-L87F、sAtCAX3-L87C、sAtCAX3-L87V和sAtCAX3-L87G，仍可使酵母突變株 K667在 Ca2+培養(yǎng)基中生長，且抑制酵母突變株的Ca2+敏感性能力與sAtCAX3-I突變株相等或降低；而突變?yōu)?sAtCAX3-L87A、sAtCAX3-L87S和sAtCAX3-L87E無Ca2+轉(zhuǎn)運活性。盡管難以從以上研究中推斷CaD的作用模式，但可肯定 L87不能自抑制，Ile也不是專一性轉(zhuǎn)運活性所必須的。推測賦予sAtCAX3 Ca2+轉(zhuǎn)運能力的CaD可能形成一種特定的三維結(jié)構(gòu)，而抑制 sAtCAX3的CaD序列形成與之不同的結(jié)構(gòu)[20]。

CaD以親水環(huán)的形式將 TM1和TM2分開 (如圖 2)，但其調(diào)節(jié) Ca2+轉(zhuǎn)運的機制還不清楚。Ca2+結(jié)合或轉(zhuǎn)運位點常常是酸性氨基酸，但CaD中沒有酸性氨基酸，因此，CaD可能不直接與Ca2+結(jié)合，而是通過限制跨膜功能域的運動，使 Ca2+進入或被阻擋在“孔”外[20,23]。

2.3 C功能域

AtCAX2有較廣泛的陽離子底物，AtCAX2轉(zhuǎn)基

因煙草幼苗中Ca2+、Cd2+和Mn2+的累積增加，尤其是 Mn2+耐受性增強[9]。AtCAX2可抑制酵母突變株的 Mn2+轉(zhuǎn)運缺陷，是 CAX家族中鑒定的唯一可以轉(zhuǎn)運Mn2+的反向轉(zhuǎn)運蛋白[9]。AtCAX1、AtCAX2、AtCAX3和 AtCAX4的氨基酸序列比對分析表明AtCAX2和AtCAX1有5個由9-15 aa組成的相似性很低的區(qū)域：A，AtCAX1的65-73 aa，起始于TM1；B，AtCAX1的150-160 aa，位于在TM3和TM4之間；C，AtCAX1的 175-184 aa，位于 TM4；D，AtCAX1的219-233 aa，位于TM5和TM6之間；E，AtCAX1的257-265 aa，位于TM6和酸性基序之間。AtCAX1、AtCAX3、AtCAX4和 VCAX1的 A、B、C以及 E區(qū)域差異不大，但D區(qū)域和AtCAX1的CaD相應(yīng)的9 aa序列在不同CAX中相差很大。AtCAX1的A、B、C、D或E區(qū)域以及CaD分別融入AtCAX2中，AtCAX2-A、AtCAX2-B、AtCAX2-C、AtCAX2-D、AtCAX2-E以及AtCAX2-9融合蛋白都缺失NRR，AtCAX2和這些 AtCAX2融合體均能使酵母突變株K667在 200 mmol/L CaCl2培養(yǎng)基中生長；在250 mmol/L CaCl2的培養(yǎng)基中，表達 AtCAX2、AtCAX2-9、AtCAX2-C、AtCAX2-D 或 AtCAX2-E的酵母突變株生長狀況相似，而表達AtCAX2-A或AtCAX2-B的酵母突變株生長減少；AtCAX1、AtCAX2-A、AtCAX2-B或AtCAX2-C在10 mmol/L MnCl2的培養(yǎng)基中，完全不能抑制酵母突變株的Mn2+敏感性，甚至在5 mmol/L MnCl2的培養(yǎng)基中仍沒有作用；AtCAX2-A和AtCAX2-B的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性顯著低于 AtCAX2，分別降低了 57.4%和33.4%；AtCAX2-C 的 Ca2+轉(zhuǎn)運活性與 AtCAX2沒有顯著差異，但無Mn2+轉(zhuǎn)運活性，出現(xiàn)Mn2+耐受性專一性缺陷；45Ca2+和54Mn2+同位素標記表明在含Ca2+和 Mn2+的培養(yǎng)基中，只有 AtCAX2能轉(zhuǎn)運54Mn2+，AtCAX1和 AtCAX2-C不能；過量 Mn2+抑制 AtCAX2轉(zhuǎn)運45Ca2+，而對AtCAX1和 AtCAX2-C無影響，表明AtCAX2的C功能域與Mn2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性有關(guān)[13]。

AtCAX2的C功能域 (6 aa) 可分成相等的C1和C2兩部分 (3 aa)，其序列與AtCAX1對應(yīng)的氨基酸序列不同。AtCAX2-C2 (AtCAX1的 IAN取代AtCAX2的 LVF) 融合體與 AtCAX2一樣，能有效抑制酵母突變株K667的Mn2+和Ca2+敏感性，特異性轉(zhuǎn)運活性沒有降低；AtCAX2-C1 (AtCAX1的TSL取代AtCAX2的CAF) 與AtCAX2-C一樣，可抑制酵母突變株的Ca2+敏感性，Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性也無差異，但在Mn2+培養(yǎng)基中不能生長，AtCAX2-C1無Mn2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性，因此，推測CAF殘基賦予了AtCAX2 的Mn2+轉(zhuǎn)運特性。AtCAX5、AtCAX6和ZmCAX2的C1區(qū)域都存在CAF殘基，表明這些CAXs均可能轉(zhuǎn)運Mn2+[13]。酵母VCX1 的C2區(qū)域是LCF殘基，轉(zhuǎn)運活性可能與AtCAX2更相似[13]。

2.4 保守序列c-1和c-2

CAXs有 11個跨膜區(qū)域，OsCAX1a暴露在細胞質(zhì)中的 N-端有 59 aa組成的親水序列，TM6和TM7之間有一個酸性基序；擬南芥和酵母 CAXs中也有相似的特征。缺失 NRR的 OsCAX1a(OsCAX1a27△) 具有Ca2+和Mn2+轉(zhuǎn)運活性。OsCAX1a與 9個其他植物和酵母的 CAXs序列比對表明CAXs存在2個由36 aa組成的高度保守區(qū)域c-1 (GNX2EXIX4AX8VX4LGSXLSNXLXV) 和c-2 (GNAAEHX6AX5DX2LGX3GSX2QX3FX)，二者有14個氨基酸相同，7個氨基酸在兩個重復(fù)序列中都是保守的，相一致的序列為GNX2EX21GSX8[17]。

c-1位于 TM3和 TM4之間，c-2位于 TM8和TM9之間 (圖2)。c-1和c-2的氨基酸定點突變結(jié)果顯示：S155、S158、N159、G325、K339、T354和 S151與離子選擇性有關(guān)；Gly128、Asn129、Glu132、Lys144、Lys149、Gly154、Asn326、Glu329、His330、Lys341、Gly351、Ser352和Gln355是OsCAX1a轉(zhuǎn)運Ca2+和Mn2+必需的。將OsCAX1a27△的8個Cys定點突變?yōu)镾er (Cys缺失突變體)，其仍然保持OsCAX1a-27△的功能結(jié)構(gòu)，故可通過Cys點突變研究其結(jié)構(gòu)。進一步在c-1及其邊界區(qū)域定點突變引入19個Cys，其中12個突變株 (S105C、L113C、T118C、A130C、A136C、I145C、V148C、S150C、S158C、S170C、A178C和S187C) 在50 mmol/L Ca2+的液體培養(yǎng)基中生長雖有差異，但均可在200 mmol/L CaCl2的瓊脂平板培養(yǎng)基中生長；而其余 7個突變株 (A139C、K142C、G143C、E146C、V147C、L153C 和 S155C) 缺失Ca2+的耐受性，表明c-1中的7個氨基酸 (A139、K142、G143、E146、V147、L153和 S155) 是酵母中 Ca2+轉(zhuǎn)運或形成特定的結(jié)構(gòu)必需的。同樣，在c-2的25個Cys突變株中，14個突變株 (S317C、I335C、A337C、K339C、N340C、K341C、L342C、D343C、I344C、T345C、S352C、A353C、Q374C 和 D378C) 缺失Ca2+轉(zhuǎn)運活性，表明這 14 個氨基酸 (S317、I335、A337、K339、N340、K341、L342、D343、I344、T345、S352、A353、Q374和D378) 可能與OsCAX1a的活性或形成四級結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。

巰 基 試 劑 4-乙 酰 氨 基 -4’-2,2’-二 磺 酸 (4-acetamido-4’-maleimidylstilbene-2,2’-dis-ulfonic acid，AMS) 不能透過液泡膜，只能與面向細胞質(zhì)一側(cè)的Cys反應(yīng)，而BM (3-(N-maleimidylpropionyl)-biocytin)可以穿透液泡膜與親水區(qū)的Cys反應(yīng)。用BM處理c-1和c-2突變株的液泡膜泡，只有S158C、S170C、S314C、A331C、L338C、S357C和S364C突變株沒有被BM標記；若先與AMS反應(yīng)，再與BM反應(yīng)，則 c-1的 4個突變株 (T118C、I145T、A178C和S187C) 和c-2的4個突變株 (S308C、A333C、A349C和 T354C) 沒有被 BM 標記，表明這 8個氨基酸(T118、I145、A178、S187、S308、A333、A349和 T354) 暴露在細胞質(zhì)；而c-1的6個氨基酸 (S105、L113、A130、A136、V148和S150) 及 c-2的2個氨基酸 (G300和 G325)仍然可被BM標記，表明其暴露在液泡腔 (如圖 4)。c-1中的4個保守氨基酸殘基Glu132、Gly154、Ser155和 Asn159與 c-2的 4個保守氨基酸殘基 Ala337、Asp343、Gly351和 Ser352也同樣存在于動物 Na+/Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白NCX1、NCX2和CalX的保守序列α-1和α-2中。推測植物c-1和c-2可能與α-1和α-2一樣，形成反向的跨膜的凹形環(huán)，c-1環(huán)從液泡腔一側(cè)穿過膜，c-2環(huán)從細胞質(zhì)一側(cè)穿過液泡膜，在胞質(zhì)一側(cè)區(qū)域形成“離子過濾”結(jié)構(gòu)，是Ca2+、Mn2+和H+的通道[17]。

2.5 D功能域

在質(zhì)膜、液泡膜 H+-ATPase產(chǎn)生的電化學(xué)質(zhì)子梯度驅(qū)動下，液泡膜 CAXs將細胞質(zhì)中過量的Ca2+、Mn2+和 Cd2+等金屬陽離子轉(zhuǎn)運到液泡中，降低其對植物細胞的毒害。CAX的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性受細胞質(zhì)pH調(diào)節(jié)，sAtCAX2活性的最適pH較AtCAX1低。在 AtCAX2融合體 (sAtCAX2-A、sAtCAX2-B、sAtCAX2-C、sAtCAX2-D 和sAtCAX2-E)中，只有 AtCAX2-D (AtCAX1的 219-233 aa序列LKNGEASAAVLSDMQ替換了AtCAX2的221-231 aa序列THSEVHAGSSE) 改變了依賴pH的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性，其細胞質(zhì)的 pH顯著提高，與sAtCAX1依賴的pH值基本相同，表明sAtCAX2的D功能域在sAtCAX2依賴的pH的調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮重要作用。sAtCAX2的D功能域 (221-231 aa) 是位于 TMD5、TMD6之間的一個親水區(qū)域，而sAtCAX1相應(yīng)的區(qū)域沒有與之相同的氨基酸[5]。

His殘基是氨基酸中結(jié)合H+、感知pH的完美候選者，AtCAX2的 D功能域有兩個 His222和 His226殘基，sAtCAX1的相應(yīng)區(qū)域沒有His。sAtCAX2中帶正電荷的 His殘基突變?yōu)椴粠щ姾傻姆菢O性 Ala時，sAtCAX2-H222A、sAtCAX2-H226A和sAtCAX2-H222A/H226A酵母突變株與AtCAX2的酵母突變株相比，sAtCAX2-H226A能輕微地抑制突變株的Ca2+和 Mn2+敏感性，sAtCAX2-H222A或 sAtCAX2-H222A/H226A的酵母突變株均不能在含 Ca2+或Mn2+的培養(yǎng)基中生長，反向轉(zhuǎn)運活性缺失，表明His222在sAtCAX2的陽離子/H+反向轉(zhuǎn)運機制中有重要作用。進一步將 His222定點突變?yōu)閹ж撾姾傻乃嵝訟sp (D) 和帶正電荷的堿性Lys (K)，由于Lys與 His222相似，所以，AtCAX2-H222K抑制酵母突變株的 Ca2+和 Mn2+敏感性能力與 sAtCAX2一致，而 sAtCAX2-H222D則無抑制能力。sAtCAX2-H222A 的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性低于 sAtCAX2，sAtCAX2-H222K與 sAtCAX2的轉(zhuǎn)運活性相當，sAtCAX2-H222D無轉(zhuǎn)運活性，表明His222是Ca2+反向轉(zhuǎn)運活性必需的。sAtCAX1、sAtCAX2、sAtCAX2-H222K和sAtCAX2-H222A的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性依賴的胞質(zhì)pH值分析表明，sAtCAX2和sAtCAX2-H222A依賴的 pH值沒有明顯差異，sAtCAX1、sAtCAX2和sAtCAX2-H222K依賴的pH值顯著不同。堿性條件下，sAtCAX2-H222K的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運活稍高于 sAtCAX2，接近于 sAtCAX1，表明His222在感知和結(jié)合 H+中發(fā)揮作用，但不影響sAtCAX2的離子轉(zhuǎn)運專一性[5]。

圖4 c-1及其邊界的拓撲模型[17]Fig. 4 Topological model of repeat c-1 and its borders[17]. The residues that are accessible from the cytosol are indicated by gray circles (Thr118, Ile145, Ala178, and Ser187) and those that are not accessible from the cytosol are boxed (Ser105, Leu113, Ala130,Ala136, Val148, and Ser150). Residues in repeat c-1 are boldly circled.

并非所有的CAXs的TMD5和TMD6之間的區(qū)域都有His222，如AtCAX1，但AtCAX1其他跨膜區(qū)域有 7 個 His (H35、H210、H259、H338、H412、H443和H446)。由于 His可以在分子內(nèi)和分子間形成氫鍵，改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，影響蛋白質(zhì)對離子的選擇、轉(zhuǎn)運作用。將這 7個 His分別定點突變?yōu)?Ala，只有H338A突變體無 Ca2+轉(zhuǎn)運能力。AtCAX1的 His338在各種 CAXs中都是保守的，可能與離子的選擇性有關(guān)。對 His338進行多種突變，只有 3個突變體(H338K、H338N和H338Q) 能輕微的抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性，如H338N突變株的Ca2+轉(zhuǎn)運活性是sAtCAX1的25%；然而，H338N定點突變株AtCAX1-H338N的Cd2+、Zn2+轉(zhuǎn)運能力提高，Km值降低，Vmax值不變或稍有變化，表明 His338是影響sAtCAX1轉(zhuǎn)運動力學(xué)和離子專一性的關(guān)鍵氨基酸，這一結(jié)果為通過定點突變提高CAXs的 Cd2+轉(zhuǎn)運能力提供理論依據(jù)[21]。

3 CAXs的功能

AtCAX1、AtCAX2因可抑制酵母突變株 K667液泡的 Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷而在植物中最先被鑒定[3]。AtCAX1是低親和性、高容量的 Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白，其基因的表達受Ca2+的誘導(dǎo)，對維持植物體內(nèi)Ca2+平衡有重要作用[16]；AtCAX2有較廣泛的底物，除Ca2+，還參與 Mn2+、Cd2+和 Zn2+的轉(zhuǎn)運，是惟一能轉(zhuǎn)運Mn2+的CAX[9]；AtCAX3的表達受鹽脅迫誘導(dǎo)，是鹽脅迫下主要的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白[24]；AtCAX4不能抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性，但可抑制表達IRT1的酵母突變株的Cd2+敏感性[8]，表明不同CAXs作用不同。CAX的表達或缺失不僅能引起植物表型變化[1-2]，也能改變植物對離子的耐受性和累積能力[9-10]。

3.1 CAXs參與植物的生長發(fā)育

CAX1是植物主要的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白[16]。在200 mmol/L CaCl2處理下，sCrCAX1與sAtCAX1一樣，可有效抑制酵母突變株K667的Ca2+敏感性[6]。在普通培養(yǎng)基中，擬南芥 cax1插入失活突變株cax1-1、cax1-2根發(fā)育受抑制，幼苗主根長約減少了11%，側(cè)根數(shù)分別減少了25%、10%，側(cè)根長分別減少了 50%、20%。sAtCAX1在 cax1-1植株中表達時根生長抑制表型消失[16]。表達sAtCAX1的轉(zhuǎn)基因煙草根中Ca2+含量是對照植株的2倍，葉片中Ca2+含量提高30%，轉(zhuǎn)基因煙草植株中每毫克sAtCAX1蛋白累積14 nmol Ca2+，而對照植株每毫克sAtCAX1蛋白僅累積7 nmol Ca2+；轉(zhuǎn)基因植株根部液泡每毫克sAtCAX1蛋白累積16 nmol Ca2+，對照植株為14 nmol[1]。sAtCAX1轉(zhuǎn)基因煙草植株在缺乏Ca2+的培養(yǎng)基中生長時，由于sAtCAX1將Ca2+主要儲存在液泡中，胞質(zhì)Ca2+濃度過低，需要Ca2+的部位得不到補充，因此，煙草植株出現(xiàn) Ca2+缺乏癥狀，如葉片壞疽、萎蔫，根生物量減少，生產(chǎn)力下降；若在培養(yǎng)基中添加Ca2+，可延遲或緩解Ca2+缺乏癥狀，甚至可使葉片的表型恢復(fù)正常[1]。過量表達sAtCAX1的轉(zhuǎn)基因番茄 (TCX1) 植株液泡的Ca2+轉(zhuǎn)運活性增加，葉片壞疽，并且因胞質(zhì) Ca2+缺乏引起的果頂軟腐病幾率升高。但由于大量 Ca2+累積在液泡中，TCX1果實堅實度降低延緩，貨架期延長。收獲40 d后，TCX1果實仍能保持其結(jié)構(gòu)的完整性，而對照果實則顯著皺縮；即使在腐爛期30 d后，TCX1果實的堅實度仍是對照的2倍[2]。

AtCAX2雖可抑制酵母突變株 K667液泡 Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，但其轉(zhuǎn)運Ca2+能力低于AtCAX1[5,9]。擬南芥 AtCAX2敲除突變株cax2-1和cax2-2的萌發(fā)、生長和開花時間、及根、莖、葉和花的形態(tài)與野生植株沒有明顯差異。在過量 Ca2+、Mn2+、Cd2+、Zn2+、Na+、Mg2+或 K+脅迫下 (不含 Ca2+)，cax2 植株的表型與野生型一致[7]，表明 AtCAX2的 Ca2+轉(zhuǎn)運活性較低，敲除后對植物生長影響不大。異源表達AtCAX2的轉(zhuǎn)基因煙草中的Ca2+累積量與AtCAX1轉(zhuǎn)基因植株相當，但 AtCAX2轉(zhuǎn)基因煙草植株的生長與野生型一樣健壯，Ca2+缺乏癥狀較輕[9]。擬南芥AtCAX3敲除突變株cax3對鹽、Li+和低pH敏感性提高，液泡Ca2+反向轉(zhuǎn)運活性和H+-ATPase活性在鹽脅迫下降低，說明 AtCAX3是鹽脅迫下主要的Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白[24]。AtCAX4也主要轉(zhuǎn)運 Ca2+，cax1敲除突變株液泡膜的 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運能力與野生植株相比降低了61%，在CaMV 35S啟動子驅(qū)動下表達AtCAX4的cax1-1植株液泡Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運能力與野生植株相比僅降低了33%[11]，說明AtCAX4具有較高的 Ca2+轉(zhuǎn)運活性。AtCAX4可抑制酵母突變株對 Ca2+的超敏感表型，高濃度的 Cd2+、Na+或K+能抑制sAtCAX1和sAtCAX4-9 (含有AtCAX1的CaD) 突變體的Ca2+轉(zhuǎn)運活性，而HA-AtCAX4不受影響，表明AtCAX4的Ca2+轉(zhuǎn)運專一性比sAtCAX1更強[2]；AtCAX4在番茄中的過量表達可適度的提高其 Ca2+水平，沒有出現(xiàn)生長副作用，果實貨架期延長[2]。表明過量表達 AtCAX4可以強化植物的 Ca2+營養(yǎng)，從而為延長農(nóng)產(chǎn)品的貨架期提供了一條可選擇的途徑。

3.2 CAXs參與二價陽離子轉(zhuǎn)運與解毒

AtCAX2可提高酵母突變株 K667和野生型的Mn2+耐受性，在維持植物胞質(zhì)Mn2+平衡中有重要作用[7]。表達 AtCAX2的轉(zhuǎn)基因煙草根組織中 Ca2+和Mn2+含量增加1倍，莖中含量增加了15%和20%；而根中Cd2+累積量是對照的3倍，莖中Cd2+含量增加了15%[9]，說明AtCAX2可參與Cd2+的轉(zhuǎn)運和解毒。AtCAX4主要在根尖、側(cè)根原基中表達，AtCAX4轉(zhuǎn)運的底物主要是Ca2+，但Cd2+存在時可有效轉(zhuǎn)運Cd2+。AtCAX4敲除突變株cax4-1和RNAi突變體在含Mn2+或Cd2+培養(yǎng)基中萌發(fā)生長時，其幼苗植株較野生型小，主根長度、側(cè)根數(shù)目顯著減少，側(cè)根的發(fā)育幾乎完全被破壞，表明Cd2+嚴重影響cax4-1的生長。與生長在2 μmol/L Cd2+培養(yǎng)基中的野生型植株相比，cax4-1的側(cè)根減少了70%。cax4-1和RNAi突變體植株子葉變黃、葉綠體數(shù)量顯著減少，HA-AtCAX4在這兩種突變體中的表達可抑制其 Cd敏感表型[11]。表明在重金屬 Cd脅迫下 AtCAX4是根生長和發(fā)育必需的。

增強液泡CAX的表達可提高植物根細胞液泡轉(zhuǎn)運二價陽離子 (Cd2+、Ca2+、Zn2+和 Mn2+) 的能力[9-10,25]。組成型表達啟動子35S分別驅(qū)動AtCAX2和 AtCAX4在煙草中表達，煙草根細胞 Cd2+濃度最多分別提高53%和34%；AtCAX4在根部特異性啟動子FS3驅(qū)動下，根液泡Cd2+和Zn2+的轉(zhuǎn)運能力提高，而Ca2+和Mn2+的轉(zhuǎn)運變化不大，表明兩種啟動子驅(qū)動 AtCAX4的表達均可提高根細胞的重金屬濃度。這可能是由于 AtCAX4在根中的特異性表達提高了Cd2+和Zn2+向液泡的轉(zhuǎn)運，或AtCAX4趨于在根組織中起作用，或通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)使其mRNA更穩(wěn)定，也可能是 AtCAX4的表達改變了液泡的二價陽離子選擇性，更偏向于累積Cd2+和Zn2+，而偏離Ca2+的轉(zhuǎn)運作用[10]。在 3 μmol/L Cd水培條件下，35S:AtCAX2和 FS3:AtCAX4轉(zhuǎn)基因煙草植株生物量分別是對照的2.8倍和1.9倍；地上部Cd的累積量分別是對照的3.4和2.4倍；另外，表達35S:AtCAX2或FS3:AtCAX4的煙草植株分別在150 μmol/L Zn或500 μmol/L Mn脅迫下，地上部Zn累積量為對照的1.9倍和2.2倍，Mn累積量是對照的2.3倍和2.8倍，表明AtCAX2和AtCAX4均可提高植物的生物量和地上部重金屬 (Cd2+、Zn2+和Mn2+) 的累積能力。同樣，在3 μmol/L Cd脅迫下，與比對照植株相比，F(xiàn)S3:AtCAX4轉(zhuǎn)基因植株根液泡膜泡的 Cd2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性提高30%，且根/地上部的Cd濃度比值增加，表明AtCAX4在煙草根中的特異性表達可提高根的 Cd累積能力，減少 Cd向地上部的轉(zhuǎn)運[25]。推測根胞質(zhì)或液泡中Cd被Cd誘導(dǎo)合成的植物絡(luò)合素螯合，或根部高濃度的Cd抑制了其向地上部的轉(zhuǎn)運。

進一步研究表明在 Cd脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草35S:AtCAX2或FS3:AtCAX4的地上部/根部Cd含量的比值遠低于對照，且轉(zhuǎn)基因植株葉片的Cd累積量比對照減少了15%~25%[26]。生長中期的35S:AtCAX2轉(zhuǎn)基因煙草植株地上部Cd含量與對照植株相比降低了 20%，而根部的 Cd含量提高了20%。對照煙草植株幼穗/35S:AtCAX2-2B根嫁接苗的根部和地上部 Cd含量的比值與轉(zhuǎn)基因植株35S:AtCAX2-2B相似；相反的嫁接煙草植株(35S:AtCAX2-2B幼穗/對照根) 根部和地上部 Cd含量的比值與對照植株相似，表明AtCAX2和AtCAX4在煙草根部的特異性表達可提高Cd在根部的累積，降低其向地上部的轉(zhuǎn)運[26]。從而可以利用CAX基因降低重金屬在地上部的累積，為綠色蔬菜和農(nóng)作物的生產(chǎn)提供一條新的途徑。

4 CAXs之間的相互影響

維持胞質(zhì)陽離子水平是多種金屬轉(zhuǎn)運蛋白共同作用的結(jié)果。擬南芥 cax1插入失活突變植株中AtCAX3、AtCAX4、ACA4 (Arabidopsis Ca2+-ATPase，isoform 4) 水平顯著提高。與野生植株相比，cax1-1植株的AtCAX3、AtCAX4和ACA4的mRNA水平分別提高了4倍、3倍和2倍，以補償AtCAX1的損失；sAtCAX1在 cax1-1中的表達導(dǎo)致 AtCAX3、AtCAX4和ACA4表達降低。表明AtCAX3和AtCAX4在維持Ca2+平衡中有一定作用，同時也表明了CAXs之間具有相互作用[18]。

轉(zhuǎn)運蛋白相互作用可以擴大其調(diào)節(jié)范圍和功能。AtCAX1和 AtCAX3的物理相互作用是植物生長和獲得養(yǎng)分所必需的。AtCAX3不是轉(zhuǎn)運 Ca2+的主要轉(zhuǎn)運蛋白，僅能輕微地抑制酵母突變株的 Ca2+敏感性。AtCAX3和 AtCAX1的反向轉(zhuǎn)運活性差異可能源于V-ATPase產(chǎn)生的pH差異。cax1突變株葉片的Mn2+和Zn2+水平降低；cax1/cax3雙突變株葉片的Mn2+和Zn2+水平升高，然而根細胞中Mn2+和Zn2+水平?jīng)]有顯著變化；同時雙突變植株中Ca2+和Mg2+的缺乏引起壞疽、葉片萎蔫等現(xiàn)象，這些離子水平的差異可能是質(zhì)子泵的變化或 CAXs之間相互作用被破壞引起的。AtCAX3主要在根中表達，在葉片中的表達水平低；AtCAX1與之相反，但是在脫落酸處理時，兩者都可在葉片保衛(wèi)細胞中大量表達，這就為研究AtCAX1和AtCAX3以二聚體的形式相互作用提供了條件[14]。

AtCAX1和 AtCAX3同時表達時可形成異二聚體，其離子轉(zhuǎn)運性質(zhì)與兩者單獨表達時的二聚體不同。AtCAX1或AtCAX3在酵母突變株的表達只能輕微的抑制其Ca2+敏感性，但是AtCAX1+AtCAX3共表達時可顯著抑制酵母突變株在150 mmol/L CaCl2培養(yǎng)基中的 Ca2+敏感性，表明二者相互作用可改變其轉(zhuǎn)運活性。AtCAX1+AtCAX3共表達的酵母突變株耐Li+，而sAtCAX1或sAtCAX3單獨表達時均無耐性；其它 CAXs共表達時沒有出現(xiàn)相似的結(jié)果，如AtCAX2和AtCAX4，表明AtCAX1和AtCAX3可形成具有新轉(zhuǎn)運能力的二聚體。推測 AtCAXs的相互作用可導(dǎo)致構(gòu)象改變，從而引起酶對底物親和力改變[14,27]。

酵母分離泛素評價 (Yeast split ubiquitin assay)及 AtCAX1和 AtCAX3的免疫共沉淀研究表明AtCAX1與AtCAX3具有物理相互作用。AtCAX1和AtCAX3在植物細胞中共表達時可形成CAXs異源二聚體，AtCAX1+AtCAX3復(fù)合物可能是特定脅迫條件下必需的[27]。

酸性氨基酸基序可將 CAXs蛋白分成輕微相似性的 N-端和 C-端兩部分，即 N-sCAX和 C-CAX。N-sCAX1和C-CAX3均獨立定位在同一酵母細胞內(nèi)膜上，且發(fā)生物理相互作用。研究發(fā)現(xiàn)CAXs的N-端部分調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運活性，而C-端部分決定CAXs的耐鹽表型。表達sCAX1的酵母對Ca2+有耐受性，對Na+和Li+敏感，而表達CAX3的酵母對Na+和Li+稍有耐性，但對Ca2+敏感。共表達N-sCAX1+C-CAX1的酵母 K667耐 Na+、Li+和 Ca2+。相反，共表達N-sCAX3+C-CAX3或 N-sCAX1+C-CAX3的酵母K667對 Ca2+敏感，但耐 Na+。在高濃度 Ca2+和 Li+條件下，表達 N-sCAX1+C-CAX1和 N-sCAX1+CCAX3的酵母 Ca2+、Li+和 Na+的累積增加。N-sCAX1+C-CAX1比 N-sCAX1+C-CAX3累積的Ca2+多，而后者累積更多的Li+。這些結(jié)果表明異源CAX復(fù)合物有較好的可塑性，為設(shè)計新型CAX轉(zhuǎn)運蛋白提供了一種全新的方法[28]。

5 展望

CAX廣泛存在于細菌、真菌、盤基網(wǎng)柄菌、植物和低等脊椎動物[4]。植物 CAXs可將胞質(zhì)中過量的Ca2+轉(zhuǎn)運到液泡，調(diào)節(jié)胞質(zhì)中Ca2+濃度[2]，以保持植物正常的生理代謝。擬南芥有6個CAXs中，現(xiàn)已鑒定的AtCAX1-4表達的組織部位特異性不同[14,7-8]，然而，其在小液泡和中央液泡膜的定位是否存在差別未見報道。

AtCAXs反向轉(zhuǎn)運活性和底物特異性取決于 4個功能域：N-端NRR、CaD、C功能域和D功能域。AtCAX1的NRR可與RDR相互作用，導(dǎo)致自抑制作用，使其 Ca2+轉(zhuǎn)運活性喪失；當 NRR缺失時，sAtCAX1可恢復(fù)其Ca2+轉(zhuǎn)運活性[15,18]，但是，發(fā)生自抑制時 CAXs蛋白構(gòu)象發(fā)生哪些變化至今還不清楚。AtCAX1的Ca2+轉(zhuǎn)運活性受NRR結(jié)構(gòu)完整性的調(diào)節(jié)，N-端缺失不同數(shù)目氨基酸殘基的 AtCAX1，其 Ca2+轉(zhuǎn)運活性有不同程度的提高；然而，完全缺失 NRR的 AtCAX4只能輕微的抑制酵母突變株的Ca2+敏感性，相反延長 N-端的AtCAX3和 AtCAX4的Ca2+轉(zhuǎn)運活性均提高[2,15]。因此NRR對CAXs反向轉(zhuǎn)運活性的調(diào)節(jié)機制還需進一步研究。CaD決定CAXs的 Ca2+轉(zhuǎn)運能力[23]，然而，其如何調(diào)控 Ca2+轉(zhuǎn)運活性尚不清楚。AtCAX2參與植物Mn2+裝載和卸載，其中 C功能域是 Mn2+轉(zhuǎn)運必需的，表達AtCAX2的煙草對Mn2+的耐受性稍有增加，但 Cd2+耐受性沒有增加[9]，因此，進一步研究 C功能域的氨基酸序列，改變其離子轉(zhuǎn)運特性，以提高植物累積重金屬的能力；Zn2+可抑制AtCAX2的45Ca2+轉(zhuǎn)運活性，推測C功能域可能也參與Zn2+轉(zhuǎn)運[13]。拓撲結(jié)構(gòu)預(yù)測表明 AtCAX2的 D功能域位于 TM5和TM6，推測其面向液泡腔一側(cè)，然而，其可調(diào)節(jié)胞質(zhì)的pH，因此，D功能域面向液泡腔一側(cè)的推測可能是錯誤的。另外，D功能域也許可與面向細胞質(zhì)一側(cè)的pH感應(yīng)區(qū)發(fā)生間接作用，調(diào)節(jié)胞質(zhì)的pH[5]。因此，需要進一步分離純化CAXs，研究其高級結(jié)構(gòu)。

CaD與C功能域都與金屬離子轉(zhuǎn)運的專一性有關(guān)[13,20]，深入研究 CAXs結(jié)構(gòu)可設(shè)計專一性的金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白，將礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)運到蔬菜和水果可食用的部分。AtCAX1和AtCAX4轉(zhuǎn)基因番茄果實中除Ca2+水平提高外，Cu2+、Fe2+和Mg2+等含量也升高，且果實的儲存期延長[2]。AtCAX1突變體 AtCAX1-H338N的Cd轉(zhuǎn)運能力增強。表達AtCAX1-H338N的矮牽牛 Petunia hybrida Cd耐受性和累積能力提高。在 50 μmol/L或 100 μmol/L CdCl2中生長 6周，轉(zhuǎn)基因植株較對照植株健壯，Cd累積量是對照的2.5倍，并且形態(tài)和發(fā)育特征沒有受影響[29]。AtCAX2和AtCAX4也有Cd2+/H+反向轉(zhuǎn)運活性，在植物根部表達可減少 Cd2+在地上部的累積[10,26]。一方面，可以通過提高AtCAX2和AtCAX4的表達或基因修飾，降低 Cd2+在植物可食用部分的累積，減少人類對重金屬Cd的攝入；另一方面，應(yīng)用基因工程的技術(shù)提高Cd超富集植物中Cd2+向地上部的轉(zhuǎn)運，為Cd污染土壤的植物修復(fù)提供技術(shù)支持。

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Structure and function of tonoplast Cation/H+antiporters in plant: a review

Yuxiu Zhang1, Xiaojing Peng1, Tuanyao Chai2, Chunling Zhang3, and Jinguang Liu1
1 School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology (Beijng), Beijng 100083, China
2 College of Life Science, Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
3 Hebei Welcome Pharmaceutical Corporation Limited, Shijiazhuang 050031, China

Received: July 14, 2010; Accepted: November 9, 2010

Supported by: National Major Special Project on New Varieties Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2009ZX08009-130B), Fundamental Research Funds for the Central University (No. 2010YH05).

Corresponding author: Tuanyao Chai. Tel: +86-10-88256343; E-mail: tychai@gucas.ac.cn

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (No. 2009ZX08009-130B)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金 (No. 2010YH05) 資助。