PCR結(jié)合反向膜雜交快速鑒定臨床常見(jiàn)念珠菌方法學(xué)的建立

李 娟,李從榮,李 艷,顧 劍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢430060)

深部真菌感染往往繼發(fā)于其他系統(tǒng)性疾病,臨床表現(xiàn)不典型,容易與原發(fā)病相混淆,診斷比較困難,而治療時(shí)機(jī)的延誤往往導(dǎo)致高感染率和高死亡率。來(lái)自美國(guó)休斯頓的一項(xiàng)研究表明,早期抗真菌治療可極大改善病人預(yù)后[1]。

念珠菌屬是深部真菌感染中最常見(jiàn)的病原菌,且存在天然耐藥現(xiàn)象。本研究以18S rDNA基因和5.8S rDNA基因的保守序列設(shè)計(jì)真菌通用引物,以內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1段設(shè)計(jì)種特異性探針,利用PCR結(jié)合反向膜雜交技術(shù),達(dá)到快速檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病念珠菌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株及生物學(xué)試劑 白色念珠菌,熱帶念珠菌,近平滑念珠菌,都柏林念珠菌,光滑念珠菌,克柔念珠菌,均是來(lái)源于衛(wèi)生部臨檢中心質(zhì)控菌株;季也蒙念珠菌;葡萄牙念珠菌;毛霉菌;清酒酵母;新生隱球菌;曲霉菌均由本院微生物室從臨床標(biāo)本中分離。Taq DNA聚合酶,10×PCR buffer,MgCl2,dNTPs;DNA marker,TE緩沖液(pH 8.0);TdT末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶;尼龍雜交膜;dTTP均由日本TaKaRa公司公司提供。凱普雜交配套試劑:由凱普科技生物公司提供。

1.1.2 引物及探針的設(shè)計(jì)

①參考Catriona Halliday[2]等人設(shè)計(jì)的通用引物擴(kuò)增真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1。Its1F:19TCCGTAGGGAA CCTGCGG37;its1R:237CGCTGCGYTCTTCATCGATG208。3'端均采用生物素標(biāo)記。

②根據(jù)ITS1基因序列多態(tài)性設(shè)計(jì)探針[3]

探針序列(5'→3') Tm(℃)C.albicans TTTATCAACTTGTCACACCAGA 68.4 C.tropicalis CTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACC 64.5 C.krusei TGTGGAATATAGCATATAGTCGACAAGAG 64.8 C.glabrata TGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATC 68.2 C.dubliniensis ACATGTGTTTTGTTYTGGACAAACTTG 67.3 C.parapsilosis CTGCCAGAGATTAAACTCAACCAA 65.1

陽(yáng)性對(duì)照探針:TCCGTAGGGAACCTGCGG

1.2 方法

1.2.1 采用蛋白酶K-SDS法提DNA[4],置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 反應(yīng) 10×PCR Buffer 2.5 μ l,2.0 mmol/L dNTP 2.5 μ l,1.5 mmol/L MgCl21.5 μ l,10 pmol/L生物素標(biāo)記的上、下游通用引物各1 μ l,0.5 U Taq DNA 聚合酶 1.0 μ l,DNA 模板 5 μ l,雙蒸水補(bǔ)足至25 μ l。97℃預(yù)變性10 min后,進(jìn)入循環(huán)。95℃變性3 min,53℃退火30 s,72℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸7 min。

1.2.3 反向膜雜交 雜交膜的制備:5×dTTP buffer 4 μ l,TdT 4 μ l,dTTP 5 μ l,10 pmol oligo 1 μ l,雙蒸水補(bǔ)足至 20 μ l體積,于 37 ℃水浴60 min,后加入 2 μ l 0.5 mmol/L EDTA,70℃s水浴10 min行終止反應(yīng)。然后將上述反應(yīng)液點(diǎn)滴于尼龍雜交膜上。在紫外燈下照射2 min,后烘干備用。按此方法制備含陽(yáng)性對(duì)照探針以及目標(biāo)探針的尼龍膜。

雜交前操作前準(zhǔn)備:按照凱普雜交儀使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

雜交:置PCR產(chǎn)物于PCR儀做解鏈反應(yīng)(變性)(95℃5 min,4℃2 min以上),同時(shí)向雜交膜上加45℃雜交液500 μ l,孵育2 min以上。開(kāi)泵吸走殘余雜交液 ,將變性PCR 產(chǎn)物20 μ l與500 μ l 45℃雜交液混合,加于雜交膜上,蓋板孵育10 min。開(kāi)泵吸走雜交液,洗膜2次。調(diào)整雜交儀溫度為25℃,加500 μ l封阻液封閉5 min后吸走封阻液。此時(shí)溫度應(yīng)在25±3℃,加入500 μ l酶標(biāo)液,孵育3.5min后吸走 。調(diào)整雜交儀溫度為 36℃,加溶液A500 μ l洗膜 3次。之后加入顯色劑NBT/BCIP 500 μ l顯色 3 min,吸走顯色劑后加溶液B500 μ l洗膜3次。漂洗一次。取出雜交膜,閱讀結(jié)果,藍(lán)紫色圓點(diǎn)為酶學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 引物的通用性和特異性評(píng)價(jià)

圖1 通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

8株實(shí)驗(yàn)菌株均能通過(guò)PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物,大小為218 bp,以下幾種臨床分離株:曲霉菌、毛霉菌、清酒酵母、新生隱球菌均能擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物,大小從200 bp-500 bp不等(見(jiàn)圖1)。

2.2 試驗(yàn)菌株雜交結(jié)果

反向膜雜交均能將念珠菌鑒定到種(見(jiàn)圖2-7),且所有基因型別可以在同一張膜上進(jìn)行檢測(cè)(見(jiàn)圖8),而正常人類基因組DNA及臨床常見(jiàn)的幾種真菌雜交結(jié)果均為陰性。

圖2 白色念珠菌雜交圖譜

圖3 熱帶念珠菌雜交圖譜

圖4 近平滑念珠菌雜交圖譜

圖5 都柏林念珠菌雜交圖譜

圖6 光滑念珠菌雜交圖譜

圖7 克柔念珠菌雜交圖譜

圖8 六種念珠菌同時(shí)雜交圖譜

2.3 鑒定時(shí)間的比較

整個(gè)檢測(cè)過(guò)程包括雜交膜的制備、臨床標(biāo)本DNA的提取、PCR反應(yīng)以及蓋板雜交,共耗時(shí)約5-6個(gè)小時(shí),由于雜交膜事先可以制備好,并可在常溫干燥環(huán)境存放半年左右,故整個(gè)檢測(cè)過(guò)程實(shí)際上最短在3-4小時(shí)內(nèi)即可完成,而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法至少需耗時(shí)48小時(shí)。

3 討論

深部真菌病的死亡率往往在40%以上,特別是ICU病房的重癥患者,深部真菌感染的死亡率更高,由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性,確診仍依賴于組織中發(fā)現(xiàn)真菌成分和相應(yīng)的陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果,但這些傳統(tǒng)的方法敏感性不高,往往容易失去最佳救治機(jī)會(huì),因此,如何提高真菌感染的早期、特異診斷水平是目前臨床真菌學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),也是臨床檢驗(yàn)工作中亟待解決的問(wèn)題。將病原真菌鑒定到種水平的臨床意義主要在于藥物選擇,因?yàn)椴煌N對(duì)抗真菌藥物的敏感性不同,如克柔念珠菌對(duì)氟康唑天然耐藥、對(duì)兩性霉素B不夠敏感;光滑念珠菌對(duì)氟康唑不夠敏感;土曲霉、波氏假霉樣真菌、毛孢子菌等對(duì)兩性霉素B天然耐藥;接合菌對(duì)除泊沙康唑外的唑類藥物均不敏感等[5]。如果鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些真菌,將可避免臨床用藥上的偏差。

目前臨床上分離的深部真菌仍以念珠菌屬為主,霉菌的分離率相對(duì)較低,美國(guó)馬塞諸塞州在2008-2009兩年內(nèi)對(duì)79個(gè)醫(yī)學(xué)中心監(jiān)測(cè)的真菌血培養(yǎng)陽(yáng)性的1239例病原菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),白色念珠菌仍居于首位,達(dá)到50%,其余依次為光滑念珠菌17.4%,近平滑念珠菌17.4%,熱帶念珠菌9.8%,克柔念珠菌1.8%[6]。

真菌的 rDNA基因是一種串聯(lián)重復(fù)基因,即18SrDNA-ITS1-5.8SrDNA-ITS2-28SrDNA轉(zhuǎn)錄單位,分隔18S、5.8S、28SrDNA基因亞單位的序列稱為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed space,ITS),為非編碼區(qū)。由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體受到的選擇壓力較小,進(jìn)化速率較快,在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性。同時(shí)ITS序列長(zhǎng)度適中,序列中有足夠的信息,可廣泛用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)學(xué)研究[7]。

PCR結(jié)合反向膜雜交技術(shù),是用生物素標(biāo)記通用引物,PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物變性后與固定在尼龍膜上的特異性探針進(jìn)行雜交,探針捕獲的生物素和標(biāo)記堿性磷酸酶的鏈酶親合素特異性結(jié)合后,酶催化底物顯色,在尼龍膜上顯出藍(lán)紫色斑點(diǎn)。這樣使得特異性得到大大提高,同時(shí)SA-AP標(biāo)記顯色系統(tǒng)也使得檢測(cè)靈敏度得到提高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所選用的探針均能檢測(cè)出相應(yīng)的靶序列,每張膜上只有陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)和與靶序列對(duì)應(yīng)的探針點(diǎn)有陽(yáng)性結(jié)果,其他探針點(diǎn)均為陰性。6種念珠菌的PCR產(chǎn)物與膜雜交,在特異性探針位點(diǎn)上均出現(xiàn)雜交斑點(diǎn),表明此方法可檢測(cè)幾種菌的混合感染。由于尚未設(shè)計(jì)霉菌、清酒酵母、隱球菌的檢測(cè)探針,因此,這三種菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性,雜交結(jié)果均為為陰性,而正常人類基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果及雜交結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)使用的探針未有非特異性的交叉反應(yīng),可以對(duì)真菌進(jìn)行種間分型檢測(cè),顯示了較好的特異性和敏感性。

另外,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程包括雜交膜的制備共耗時(shí)約5-6個(gè)小時(shí),由于雜交膜事先可以制備好,并可在常溫干燥環(huán)境存放半年左右,故整個(gè)檢測(cè)過(guò)程實(shí)際上最短在3個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成,而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要耗時(shí)約48小時(shí),這對(duì)于指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥,減少因經(jīng)驗(yàn)性治療導(dǎo)致的耐藥問(wèn)題亦具有重要的意義。

[1]Garey KW,Rege M,Pai M P,et al.Time to initiation of fluconazole therapy impacts mortality in patients with candidemia:A multi-institutional study[J].Clinical Infectious Diseases,2006,43(1):25.

[2]Catriona Halliday,SharonChen,Anna Lau,et al.Sorrell Reverse Line Blot Hybridization Assay for Identification of Medically Important Fungi from Culture and Clinical Specimens[J].J Clin Microbiol,2007,45:2872.

[3]Ciardo DE,Ciardo DE,Sch?r A,et al.Internal transcribed spacer sequencing versus biochemical profiling for identification of medically important yeasts[J].Clin Microbiol,2006,44:77.

[4]向華國(guó),熊禮寬,涂植光.幾種提取生殖道常見(jiàn)病原菌DNA方法的比較[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.2006,21(5):54.

[5]李若瑜.應(yīng)用現(xiàn)代化診斷方法提高我國(guó)真菌病診斷水平[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,31(2):125.

[6]PfallerMA,Castanheira M,Messer SA,et al.Variation in candida spp.distribution and antifungal resistance rates among bloodstream infection isolates by patient age:report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program(2008-2009).Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2010,68(3):278.

[7]Iwen PC,Hinrichs SH,Rupp ME.Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens[J].Medical Mycology,2002,40(1):87.