一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離及鑒定

梁盛年

（肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離及鑒定

梁盛年

（肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

從中國南方紅豆杉三齡樹樹皮中分離得到內(nèi)生真菌ZU07，經(jīng)液體發(fā)酵，用高效液相色譜技術(shù)對該真菌的發(fā)酵液提取物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明菌株ZU07能合成抗癌藥物紫杉醇，其紫杉醇含量約為214．45 μg/L．

中國南方紅豆杉;紫杉醇;內(nèi)生真菌;高效液相色譜法

紫杉醇（Paclitaxel，商品名為Taxol）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的抗癌藥物之一．臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉醇對治療婦科腫瘤（包括卵巢上皮癌和乳腺癌）效果較好，對其他腫瘤（如肺癌、前列腺癌、食道癌等）也顯示出良好的治療前景[1]．然而紫杉醇藥源不足極大地限制了其在臨床中的應(yīng)用，開辟新的紫杉醇來源一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)．Strobel G[2]首次從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中分離得到可產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，這一發(fā)現(xiàn)開辟了生產(chǎn)紫杉醇的新途徑．其后，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道從不同種的紅豆杉樹上分離出能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌[3－8]，但那些紅豆杉樹的樹齡均在幾十年甚至百年以上，并且因生態(tài)環(huán)境不同，分離所得的內(nèi)生真菌產(chǎn)出紫杉醇的能力亦不同，野生菌株產(chǎn)出紫杉醇普遍在200 μg/L以下[9]．產(chǎn)率最高的是周東坡等[6]組建的一株工業(yè)菌株，產(chǎn)率為448．52 μg/L，均未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求（工業(yè)化生產(chǎn)要求紫杉醇的產(chǎn)量要達(dá)到1 mg/L以上）．本文中，筆者以生長在肇慶北嶺山(地處北回歸線帶上，靠近廣東著名的鼎湖山)的中國南方紅豆杉（Taxus mairei）三齡樹為材料，進(jìn)行了產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌分離研究，旨在從中分離出高產(chǎn)率的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，以期為我國在世界上爭取和利用微生物資源創(chuàng)造有利條件．

1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1)紅豆杉：采自生長于肇慶北嶺山的三齡中國南方紅豆杉（Taxus chinensis var．mairei）．

2)培養(yǎng)基：根據(jù)需要采用固體和液體2種培養(yǎng)基．

分離時(shí)選用PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為6．8．配制方法是將馬鈴薯去皮切碎，水煮30 min；用2～3層紗布過濾，溶入葡萄糖及瓊脂后加水定容．在121℃的溫度下滅菌20 min，冷卻至60～70℃時(shí)加入100 mg/L氯霉素．斜面培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中不加入氯霉素．

發(fā)酵時(shí)選用PDA液體培養(yǎng)基：配制方法同上，不加入瓊脂和氯霉素，分裝至500 mL三角瓶中，每瓶100 mL，在121℃的溫度下滅菌20 min．

3)萃取液：乙酸乙酯－丙酮（體積比1∶1）．

4)紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣：購自Sigma公司．

5)HPLC色譜儀：WatersTM600高效液相色譜儀，Waters 2487檢測器，Millenium32色譜管理系統(tǒng)（美國Waters公司生產(chǎn)）．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 菌株分離方法

取三齡樹的中國南方紅豆杉的根、莖、葉片，先用自來水洗凈；將莖的樹皮剝下后切成1．0 cm×1．0 cm的小方塊，根和葉片則直接切成1．0 cm×1．0 cm的小方塊，用無菌水洗凈；然后浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精中進(jìn)行表面消毒，5 min后取出，再用無菌水反復(fù)洗凈后，置于裝有PDA固體培養(yǎng)基的平皿中央（每皿1塊）；將平皿置于溫度為28℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 d，待長出菌絲后，挑取不同菌絲末端接種到新的PDA培養(yǎng)基平皿上；再于28℃的溫度下培養(yǎng)3 d，連續(xù)接代純化(6～7次),即可得一純菌株．最后在PDA斜面培養(yǎng)基上于28℃的溫度下培養(yǎng)3 d，置于冰箱保存．

1．2．2 ZU07菌株的液體培養(yǎng)

在500 mL三角瓶中裝入100 mL液體培養(yǎng)基，滅菌、冷卻后在培養(yǎng)基中接入斜面菌絲，在28℃的溫度下用搖床培養(yǎng)7 d，搖床速度為200 r/min．

1．2．3 紫杉醇的提取與標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

1)紫杉醇的提?。簩l(fā)酵液以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，取上清液于60℃的溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/10體積后，加入等體積的乙酸乙酯－丙酮（體積比1∶1）萃取2次，棄水相收集有機(jī)相；沉淀的菌體用組織搗碎儀處理后，經(jīng)低溫凍溶2次，加入一定量的乙酸乙酯－丙酮（體積比1∶1）萃取液用超聲波細(xì)胞破碎儀處理15 min，然后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心；取上清液和前面的有機(jī)相液體混合于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘留物用5 mL的甲醇溶解，溶解液用5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液過濾后保存?zhèn)溆茫?/p>

2)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：將5 mg紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容至10 mL，過濾備用．

1．2．4 采用高效液相色譜技術(shù)檢測真菌培養(yǎng)物中紫杉醇的含量

HPLC條件：Xterra RP185 μm柱（Waters公司生產(chǎn)），柱的規(guī)格為3．9 mm×150 mm，等濃度洗脫；流動相：甲醇－乙腈－水（體積比為25∶35∶40），流速為1．4 mL/min；檢測波長為227 nm；進(jìn)樣量為20 μL．

2 結(jié)果與分析

2．1 紅豆杉樹皮上微生物的類群及目的菌種的篩選

從南方紅豆杉三齡幼樹的根、莖、葉片中共分離得到23株內(nèi)生真菌，分別以ZU01～ZU23編號標(biāo)志（其中ZU表示肇慶學(xué)院，01～23表示序號），其中有1株（編號為ZU07，從主莖樹皮中分離得到）的孢子和菌絲的顯微結(jié)構(gòu)與葛青平[10]所研究的紫杉醇產(chǎn)生菌——HU1353極為相似，因此選取ZU07作為主要研究對象．

2．2 菌株ZU07的形態(tài)觀察及分類定位

菌株ZU07在PDA培養(yǎng)基上于28℃的溫度下培養(yǎng)，開始為白色，第3天變?yōu)楹稚?，?天可生長到6 cm；背部呈黑色，無滲出液；菌落呈褐色，平展、致密；邊緣整齊呈灰白色絨毛狀，見圖1．該菌株的菌絲和分生孢子梗具橫隔，菌絲多分枝，大小不一，見圖2．分生孢子單生或連成鏈狀，形狀為卵形和倒棍棒形，壁呈磚狀，光滑、具啄且有橫隔，見圖3～4．這些特征與半知菌亞門（Deuteromycotina）,絲孢綱（Hyphomycetes）、暗色孢科（Dematiaceae）、鏈格孢屬[11]（Alternaria spp）的分類特征相吻合．此外，因與葛菁萍等[10]從東北紅豆杉中分離到的一新種紅豆杉鏈格孢完全相同，故定位為紅豆杉鏈格孢（Alternaria taxi）．

圖1 ZU07菌落形態(tài)（培養(yǎng)7 d）

圖2 ZU07菌絲形態(tài)及孢子著生形態(tài)（400倍）

圖 3 ZU07孢子形態(tài)（400倍）

圖4 ZU07孢子及其孢子喙（400倍）

2．3 高效液相色譜測定

采用高效液相色譜系統(tǒng)對ZU07發(fā)酵液提取物進(jìn)行定性與定量檢測，結(jié)果如圖5所示．

圖 5 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和ZU07菌株HPLC圖譜

由圖5可見，ZU07發(fā)酵液提取物中含有與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品UV圖譜、Rt值較為接近的色譜峰，標(biāo)準(zhǔn)品Rt值為3．702,而ZU07發(fā)酵液提取物為3．700，兩者接近，表明ZU07發(fā)酵液提取物中含有紫杉醇類化合物的成分．根據(jù)峰的積分面積計(jì)算得出樣品中紫杉醇的含量，再根據(jù)發(fā)酵液總量可計(jì)算出ZU07菌株液體培養(yǎng)物中紫杉醇的質(zhì)量濃度約為214．45 μg/L，此為目前國內(nèi)從紅豆杉屬樹皮中分離出能產(chǎn)紫杉醇的菌株中產(chǎn)量較高的野生菌株，值得進(jìn)一步深入研究．

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[11] 張?zhí)煊?鏈格孢屬[M]//中國真菌志:第16卷.北京:科學(xué)出版社,2003:233.

Isolation and Identification of Endophytic Fungus Associated Containing Taxol

LIANG Shengnian

(College of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China)

A strain of endophytic fungus which remark ZU07 was isolated from the inner bark of threeyear-old Taxus chinensis var.mairei,by HPLC of the culture fluid from the fermentation of fungus,the results showed that ZU07 could synthesize anti-cancer drugs of Taxol,its content was about 214.45 μg/L.

Taxus chinensis var.mairei;Taxol;endophytic Fungus;HPLC

S459

A

1009－8445（2011）02－0061－03

(責(zé)任編輯：陳 靜)

2009－06－15

梁盛年（1973－）,男,廣東肇慶人,肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師．