響應(yīng)曲面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取條件

李光*，李學(xué)蘭，孫慧峰，刀兆玲

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 66610 0；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150 0 40；3.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650 50 0）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取條件

李光1*，李學(xué)蘭1，孫慧峰2，刀兆玲3

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 66610 0；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150 0 40；3.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650 50 0）

目的：應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝條件，為應(yīng)用于生產(chǎn)提供參考。方法在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法的中心組合設(shè)計，考察分析提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、液料比4個主要因素對石斛多糖提取率的影響，對鐵皮石斛多糖的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化分析。結(jié)果：鐵皮石斛多糖提取的最優(yōu)條件為：提取溫度為10 0℃、提取時間為2.5h、料液比1∶17.2（m/V）、提取次數(shù)為3次。在此條件下，理論計算提取率達到51.12%，實測提取率為51.08%，與模型高度擬合。結(jié)論該工藝便捷、快速、易操作、得率較高，可用于鐵皮石斛多糖的提取。

鐵皮石斛；多糖；響應(yīng)曲面法；提取工藝

石斛多糖是鐵皮石斛Dendro bium officinale Kimuraet migo中最主要的有效成分［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛中石斛多糖具有較強的藥理活性［2-5］，具有較高的開發(fā)價值。影響鐵皮石斛多糖提取率的因素很多，如提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、物料比等，常規(guī)優(yōu)化方法得到的提取工藝不能全面展示各因素間的相互影響，實際操作過程中造成很多產(chǎn)量損失。目前多糖提取工藝研究多采用正交試驗設(shè)計，但該方法不能在給出的整個區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個明確的函數(shù)表達式即回歸方程，從而無法找到整個區(qū)域內(nèi)因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)曲面法以其試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用的諸多優(yōu)點，在很大程度上滿足了這些要求。目前，多種植物多糖都用響應(yīng)曲面法進行測定［6-7］，都能夠優(yōu)化得到很好的提取率。關(guān)于響應(yīng)曲面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取工藝方面的研究尚未見有報道，作者在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對鐵皮石斛多糖的提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、液料比4個因素的3個水平進行中心組合試驗研究，分析得出最佳提取工藝參數(shù)，以為今后擴大應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)和參考。

1 材料、儀器與試藥

1.1 材料

鐵皮石斛 （購自西雙版納增靚生物科技有限公司）。

1.2 儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋 （國華電器有限公司），電子天平 （賽多利斯公司），分析天平 （賽多利斯公司），SHB-I V雙A循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），TGL16M湘智離心機 （安徽誠信啟動設(shè)備有限公司），U V-190 1分光光度計（北京普析儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R E-52A（上海亞榮生化儀器廠），GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），玻璃儀器氣流烘干箱 （武漢科爾儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試藥

D-無水葡萄糖對照品 （中國藥品生物制品檢定所），水為超純水，乙醚 （分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），無水乙醇 （分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），苯酚 （分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），濃硫酸 ［重慶川東化工（集團）有限公司化學(xué)試劑廠］，三氯甲烷 （分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

2 方法

2.1 鐵皮石斛多糖提取工藝

精密稱取鐵皮石斛干燥粉末0.5000g（過3號篩），置圓底燒瓶中，按設(shè)定的提取條件 （液料比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)）進行回流提取，提取時將反應(yīng)容器置于恒溫水浴鍋中，提取反應(yīng)完成后，待料液冷卻后通過抽濾進行汁渣分離，棄去沉淀，得多糖浸提液，提取液置250m L容量瓶中定容。

將以上所得的提取液，分別精密量取1m L濾液置10m L的離心管中，精密加入5m L無水乙醇，搖勻，冷藏1h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為4000r·min－1）20m i n，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次10m L，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25m L容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成1m L中含90μ g的溶液，精密量取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0m L，分別置10m L具塞試管中，各加水補至1.0m L，精密加入5%苯酚溶液1m L（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5m L，搖勻，置沸水浴中加熱20m i n，取出，置冰浴中冷卻5m i n，以相應(yīng)試劑為空白，在488nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 多糖含量測定

采用苯酚－硫酸法［8-9］。

2.4 多糖提取率的計算

2.5 單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

通過單因素試驗和查閱文獻資料確定出提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比對鐵皮石斛多糖含量有顯著影響，為了選擇最佳提取條件，依據(jù)單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Design Expert8.05b軟件進行實驗設(shè)計，分別考察提取溫度、液料比、提取時間和提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖得率的影響并進行優(yōu)化，詳見表1。

表1Box-Behnken設(shè)計因素水平表

3 結(jié)果

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

實驗制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A＝100 31C－0.0404，r＝0.9994?；貧w分析表明，在0.03～0.16m g·m L－1葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

3.2 水提法提取鐵皮石斛多糖的單因素影響

3.2.1 提取溫度對鐵皮石斛多糖提取量的影響 溫度直接影響物質(zhì)在水中的溶解度，因此對多糖提取率會有比較顯著的影響。本實驗在液料比40∶1、提取時間1.5h、提取3次的條件下，將溫度設(shè)定在70，75，80，85，90，95，100℃7個溫度，研究溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對提取率的影響

3.2.2 提取時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響 在提取溫度10 0℃、液料比40∶1、提取3次的條件下，考察提取時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對提取率的影響

3.2.3 液料比對鐵皮石斛多糖提取率的影響 提取溫度10 0℃、提取時間2.5h、提取3次的條件下，考察液料比對鐵皮石斛多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對提取率的影響

3.2.4 提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖提取率的影響 在提取溫度10 0℃、液料比30∶1、提取時間2.5h的條件下，考察提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對提取率的影響

3.3 模擬組合

結(jié)果見表2。

表2Box-Behnken設(shè)計實驗結(jié)果 /%

由表2可知，通過對提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)進行試驗優(yōu)化設(shè)計，得到相應(yīng)的二次方程模型：Y＝0.35820＋0.011091A＋0.014902B＋0.0 10343C－9.19026×10－3D＋0.0370 41A B－0.081217AC＋0.06610 8AD－0.042538C2＋3.61557×10－3D2。

表3為試驗結(jié)果進行擬和的二次模型方差分析，二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明，因素C對提取效果的線性效應(yīng)顯著，因素A C對提取效果的交互影響顯著?；貧wF值為3.59，多元相關(guān)系數(shù)為r＝62.96%，說明模型對試驗實際情況擬合較好；P＝0.0091（P＜0.0 1視為模型擬合極顯著），表明該模型高度顯著，可用來進行響應(yīng)值的預(yù)測，試驗設(shè)計方案正確。

表3 回歸分析結(jié)果

3.4 響應(yīng)曲面與等高線分析

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線，見圖5～7，比較兩組圖響應(yīng)面最高點和等高線可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點同時也是等高線最小橢圓的中心點［10］。

通過表3回歸分析結(jié)果可見，自變量 （提取溫度與物料比交互作用、提取溫度與提取次數(shù)）與響應(yīng)值（提取率）之間線性關(guān)系極顯著（P＜0.01），物料比的二項式達到顯著水平（P＜0.05）。由表3可知，各因素對多糖提取率的影響順序：提取溫度與液料比交互項＞提取溫度與提取次數(shù)交互項＞液料比二次項＞提取溫度與提取時間交互項＞提取時間一次項＞提取溫度一次項＞液料比一次項＞提取次數(shù)一次項＞提取次數(shù)二次項。

Design-Expert8.0.5軟件處理得響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5～7。由圖可知，因素提取溫度、提取時間、液料比、提取次數(shù)交互影響很復(fù)雜，可能是由于在提取過程中多糖出現(xiàn)水解情況造成的。

圖5 提取溫度與提取時間對多糖提取率的影響

圖6 提取溫度與液料比對多糖提取率的影響

圖7 提取溫度與提取次數(shù)對多糖提取率的影響

由Design-Expert8.0.5軟件得到優(yōu)化條件的處理，確定最優(yōu)提取工藝關(guān)鍵因素為提取溫度100℃、提取時間2.5h、料液比1∶17.2（m/V）、提取次數(shù)為3次，理論計算提取率達到51.12%。在此基礎(chǔ)上進行驗證實驗，實測提取率51.0 8%，與預(yù)測值較接近。

4 討論

本實驗通過響應(yīng)面試驗設(shè)計方法考察了提取時間、提取溫度、提取次數(shù)和液料比對石斛多糖提取率的影響。二次方程的模型 （總）回歸極顯著差異，且第二次方差分析后的失擬項檢驗不顯著，說明通過本實驗所建立的二次回歸方程成功地反映了所考察的4個因素與響應(yīng)值之間的相關(guān)性，試驗設(shè)計科學(xué)合理，在提取石斛多糖的過程中提取溫度和液料比的交互項影響極顯著，實驗結(jié)果表明，石斛多糖提取工藝過程中，隨物料比增加產(chǎn)率降低，這可能是由于石斛多糖溶解性好，少量溶劑就能夠很好溶解，由于得到石斛多糖溶液比較黏稠，在過濾過程中損失較大，所以較小液料比能夠得到較大得率。最終方程模擬得到石斛多糖提取最佳工藝條件為提取溫度100℃、提取時間2.5h、料液比1∶17.2（m/V）、提取次數(shù)為3次，理論計算提取率達到51.12%。在此基礎(chǔ)上進行驗證實驗，實測提取率51.08%，與預(yù)測值較接近。這種優(yōu)化提取方法可以在石斛多糖提取工藝研究中進一步推廣。

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Optimization of Extraction of Dendrobium candidum Polysaccharides Using Response Surface Methodology

LI Guang1，LIXue-lan1，SUNHui-feng2，DAOZhao-ling3
（1．Yunnan Branch，Institute of medicinal Plant，Chinese Academy of medical Sciences，Peking Union Medical College，Jinghong 666100，China；2.College of Pharmacy，Heilong jiang University of Trad itional Chinese medicine，Harbin150040，China；3.Yunnan Universityof Traditi onal Chinese medicine，Kun ming650500，China）

Objective：To obtain the optimal conditions of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium candidum，and to provide the theoretical foundation for the further processing and utilization of Dendrobi-um candidum.Methods：On the basis of the single factor test，response surface methodology was applied to optimize the main extraction conditions.Results：The Results showed that extraction time，water-feed ratio and extraction tem-perature all had significant effects on the extraction rate of polysaccharides.Obvious correlation was found to be existed between extraction time and extraction temperature.The optmal extraction time was 2.5h and the optimal water-feed ratio was 17.2，and the optimal extraction temperature was100℃ Under these optimized conditions，the extraction rate of polysaccharides was51.12%.ConclusionMultivariate regression analysis showed that the model of extraction time，water-feed ratio，extraction temperature and extraction rate of polysaccharides could be forecasted by applying the model.

Dendrobium candidum；Response surface methodology（RSm）；Polysaccharides；Ultrasonic extraction

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項（YZYN-10-01）

*李光，Tel：（0691）2136981；E-mail：lhbg311＠hotmail.com

2011-06-30）