Arthrobacter sp.No.3細(xì)菌酶轉(zhuǎn)化三醇類人參皂苷Rg1生成Rh1的反應(yīng)條件

孫 斯 宜， 宋 建 國， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學(xué) 化工與材料學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參皂苷Rh1是存在于天然藥物人參中的一種四環(huán)三萜皂苷，具有抑制癌細(xì)胞增殖，抗腫瘤作用[1]，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)[2]，有抑制體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞的生長速度和分裂能力的作用[3]。人參皂苷Rh1在天然人參中含量稀少，白參中僅為0.015%，三七參中僅為0.01%[1]，而含量較多的Rg1可以通過酶轉(zhuǎn)化生成Rh1，并且人參皂苷Rh1較其前體Rg1具有更強(qiáng)的整體和體外抗腫瘤作用[4]，因此轉(zhuǎn)化較多Rg1得到Rh1具有實際意義。

人參皂苷糖苷酶可以水解原人參二醇類皂苷或者原人參三醇類皂苷糖基，生成次生皂苷。2007年，魚紅閃等[5-6]從Aspergillussp.g48p菌株中發(fā)現(xiàn)人參皂苷糖苷酶I；2009年，從相同菌株中又提取得到人參皂苷糖苷酶II; KO等[7]報道由人參主要皂苷成分Re和Rg1，通過青霉屬(Penicillium)獲得的乳糖酶以及黑曲霉屬(Aspergillus)獲得的半乳糖苷酶來制備稀有皂苷成分Rg2和Rh1，但細(xì)菌屬獲得的酶研究較少。

于小溪[8]、王亮[9]、邵巍[10]等用新篩選的細(xì)菌Arthrobactersp.3(GS 0202和Rhodopseudomonassp.18(Terrabactersp.No.18 GS 3082)等菌種，研究了將人參二醇類皂苷轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有類皂苷的條件，發(fā)現(xiàn)25 ℃發(fā)酵主要產(chǎn)生將人參二醇類皂苷轉(zhuǎn)化成Rg3的酶，35 ℃發(fā)酵主要產(chǎn)將人參二醇類皂苷轉(zhuǎn)化成F2和C-K的酶。Arthrobactersp.No.3 GS 0202菌株所產(chǎn)的人參皂苷酶還可通過水解人參皂苷Rg1C-20位上的葡萄糖基將人參皂苷Rg1等三醇類皂苷轉(zhuǎn)化生成皂苷Rh1。

作者對該菌產(chǎn)酶的最適發(fā)酵條件和反應(yīng)條件進(jìn)行了研究。

1 實 驗

1.1 材 料

菌種：細(xì)菌Arthrobactersp.No.3 GS0202，韓國KAIST提供，由人參土壤中篩選而得到。

培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL。

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品：Rg1、Rg2、Rh1、Rh2，本實驗室提供。

1.2 儀 器

薄層層析板Silica Gel-60-F254，德國Merck公司；高效液相色譜分析儀Waters2695-2996；BR-Bio20發(fā)酵罐，BioPai公司；鼓氣泵MASTER DK-8000(60 Hz，3 W)。

1.3 方 法

1.3.1 菌體培養(yǎng)

菌種活化，接種于50 mL液體培養(yǎng)液中制作種子罐，30 ℃培養(yǎng)2 d后，取5 mL于500 mL培養(yǎng)基中，30 ℃鼓氣培養(yǎng)3～6 d。

1.3.2 酶液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)后，8 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min棄去菌體沉淀，將三倍于發(fā)酵液體積的丙酮倒入上清液中，沉降2 h，再次離心，取其沉淀，將丙酮揮干。在沉淀中加入0.02 mol/L pH 5.0 HAc-NaAc的緩沖液振蕩溶解，得到酶液。

1.3.3 酶活力測定

分別取0.1 mL酶液與等體積1 mg/mL人參皂苷Rg130 ℃反應(yīng)24 h，然后用等體積水飽和正丁醇停止反應(yīng)，TLC檢測酶活力。

1.3.4 最適發(fā)酵條件的確定

發(fā)酵時500 mL培養(yǎng)基中分別加入0.4 g蘆丁和0.05 g人參總皂苷誘導(dǎo)物進(jìn)行培養(yǎng)，3～6 d后提取酶液。酶液與等體積1 mg/mL人參皂苷Rg1分別反應(yīng)24 h，TLC檢測酶活力，確定最適誘導(dǎo)物。

1.3.5 最適酶反應(yīng)條件確定

選擇最適誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，酶液分別與等體積1 mg/mL人參皂苷Rg1在20、30、40、50 ℃下反應(yīng)24 h后，TLC檢測酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。

選擇最適誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，最適反應(yīng)溫度下分別取酶液與等體積1 mg/mL人參皂苷Rg1反應(yīng)6、9、12、16、20、24、28 h，TLC檢測酶活力，確定最適反應(yīng)時間。

選擇最適誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，最適反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間下分別取酶液與等體積2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/mL的人參皂苷Rg1反應(yīng)，TLC檢測酶活力，確定最適反應(yīng)底物質(zhì)量濃度。

1.3.6 TLC檢測

將點樣后的硅膠薄層層析板放入展開劑氯仿-甲醇-水[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水) =7∶3∶0.5]中展開，用10%的H2SO4顯色。

1.3.7 高效液相色譜法(HPLC)計算轉(zhuǎn)化率

高效液相色譜分析儀，Waters 2695-2996；色譜柱，中匯達(dá) Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；進(jìn)樣量，10 μL，體積流量，1.0 mL/min；柱溫，35 ℃；標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，1.0 mg/mL。流動相A為乙腈，流動相B為水，兩者比例如表1所示。

表1 HPLC檢測的流動相條件

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)條件確定

500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.4 g蘆丁和0.05 g人參總皂苷作為誘導(dǎo)物，30 ℃鼓氣培養(yǎng)3～6 d，取0.1 mL酶液與等體積人參皂苷Rg1底物40 ℃反應(yīng)24 h，TLC檢測酶活力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，兩種誘導(dǎo)物都能夠?qū)⑷藚⒃碥誖g1轉(zhuǎn)化為Rh1，其中人參皂苷作為誘導(dǎo)物時，產(chǎn)物Rh1得率較高，選擇人參皂苷作為最適誘導(dǎo)物。

Re、Rg1、Rg2、Rh1、Rh2，標(biāo)準(zhǔn)人參皂苷；1，以人參皂苷為誘導(dǎo)物；2，以蘆丁為誘導(dǎo)物

2.2 最適反應(yīng)條件的確定

為提高人參皂苷糖基水解酶產(chǎn)物得率，研究了人參皂苷以下反應(yīng)條件：最佳反應(yīng)溫度，最佳反應(yīng)時間和最佳底物質(zhì)量濃度。

在常見溫度范圍內(nèi)篩選最適反應(yīng)溫度。根據(jù)上述已經(jīng)確定的發(fā)酵條件培養(yǎng)后，酶液分別與等體積1 mg/mL人參皂苷Rg1在20、30、40、50 ℃下反應(yīng)24 h，TLC檢測酶活力，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，20、30、40、50 ℃下都能夠?qū)⑷藚⒃碥誖g1轉(zhuǎn)化為Rh1，其中30 ℃轉(zhuǎn)化率最好，選擇30 ℃作為最適反應(yīng)溫度。

Re、Rg1、Rg2、Rh1、Rh2為標(biāo)準(zhǔn)人參皂苷；1～4培養(yǎng)溫度分別為20、30、40、50 ℃

根據(jù)已經(jīng)確定的誘導(dǎo)物和反應(yīng)溫度，30 ℃下分別取0.1 mL酶液與等體積1 mg/mL人參皂苷Rg1反應(yīng)6、9、12、16、20、24、28 h，TLC檢測酶活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，不同的反應(yīng)時間下，都能夠?qū)⑷藚⒃碥誖g1轉(zhuǎn)化為Rh1，其中16、20、24 h的反應(yīng)較為徹底，由于24 h停止反應(yīng)時較為方便，因此選擇24 h作為最適反應(yīng)時間。

Re、Rg1、Rg2、Rh1、Rh2為標(biāo)準(zhǔn)人參皂苷; 1～7，酶反應(yīng)時間分別為6、8、12、16、20、24、28 h

根據(jù)已經(jīng)確定的誘導(dǎo)物和反應(yīng)條件，分別選擇2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/mL的人參皂苷Rg1與等體積酶液，在30 ℃條件下反應(yīng)24 h，TLC檢測酶活力，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)化為Rh1時，底物質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，轉(zhuǎn)化率最高，故選用0.1 mg/mL為最適底物質(zhì)量濃度。

Re、Rg1、Rg2、Rh1、Rh2為標(biāo)準(zhǔn)人參皂苷; 1～4，底物質(zhì)量濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/mL的人參皂苷Rg1

2.3 HPLC檢測酶解產(chǎn)物的組成

10 mL酶反應(yīng)液用水飽和正丁醇萃取、蒸干，用1.6 mL甲醇(色譜純)溶解，搖勻，用直徑0.45 μm微孔濾膜過濾，其HPLC圖譜如圖5所示。從圖5中可以看出，酶反應(yīng)后人參皂苷Rg1的峰面積和反應(yīng)產(chǎn)物人參皂苷Rh1的峰面積比值為7 523 466∶2 068 706≈4∶1，可以判斷，酶反應(yīng)中大約為20%的Rg1轉(zhuǎn)化為Rh1。

圖5 酶反應(yīng)前后的HPLC譜圖對照

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)菌Arthrobactersp.No.3 GS 0202菌株可以得到將人參三醇類皂苷Rg1轉(zhuǎn)化為Rh1的人參皂苷糖苷酶，確定菌種產(chǎn)酶的最適誘導(dǎo)物為人參總皂苷，最適反應(yīng)底物質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，其酶在30 ℃下反應(yīng)24 h，能夠?qū)?0%的人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh1。

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