固定化酶法手性轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的初步研究

姜平，孫楊，孫東陽，張怡軒

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

固定化酶法手性轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的初步研究

姜平，孫楊，孫東陽，張怡軒*

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

研究確定沙門柏干酪青霉菌(Penicillium camemberti)2221能夠產(chǎn)生手性轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的酶，以及以海藻酸鈉為載體固定化酶轉(zhuǎn)化的最適條件。以海藻酸鈉為載體，分別考察了海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、海藻酸鈉和酶用量的體積比、固定化時(shí)間等條件，以及固定化酶的最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度和反復(fù)利用的穩(wěn)定性等。結(jié)果表明，最優(yōu)固定化條件是3.0%(質(zhì)量與體積比)海藻酸鈉、3.0%(質(zhì)量與體積比)氯化鈣、酶液(濃縮20倍)和3.0%(質(zhì)量與體積比)海藻酸鈉溶液的體積比為1∶2、固定化時(shí)間為6 h。固定化酶的最適溫度為37℃，最適pH為6.2，轉(zhuǎn)化率為14.3%，連續(xù)反應(yīng)4次后轉(zhuǎn)化率為最初的57.57%。利用海藻酸鈉包埋固定化沙門柏干酪青霉菌產(chǎn)生的手性轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的酶，能夠連續(xù)轉(zhuǎn)化生成左旋磷霉素，提高酶的利用效率，延長(zhǎng)使用時(shí)間，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

左旋磷霉素;右旋磷霉素;生物轉(zhuǎn)化;固定化;海藻酸鈉

磷霉素((－)-(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙烯磷酸，(－)-(1R，2S)-1，2-epoxypropylphosphonic acid，fosfomycin，phosphonomycin，F(xiàn)OM)是1969年由Merck公司的Hendlin等［1］于Streptomyces fradiae (ATCC 21096)發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)，是一種小分子的廣譜抗生素，對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有殺滅作用，特別對(duì)綠膿桿菌、變形桿菌、鏈球菌、沙雷菌及對(duì)多種藥物有耐藥性的葡萄球菌和大腸埃希菌均能顯示優(yōu)異的抗菌活性。磷霉素分子量小、半衰期長(zhǎng)，容易滲入各種組織。其不良反應(yīng)少，主要為胃腸道和皮膚癥狀，多可耐受或?yàn)橐贿^性反應(yīng)。新生兒和兒童對(duì)磷霉素耐受性也較好［2］。由于磷霉素分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，目前工業(yè)生產(chǎn)仍使用早期發(fā)明的化學(xué)合成法，但該方法生產(chǎn)的總收率不足35%，且產(chǎn)物為外消旋體，其中有與左旋磷霉素等量的無活性的右旋磷霉素，無法加以利用［3］。因此，實(shí)現(xiàn)右旋磷霉素的轉(zhuǎn)化，是降低磷霉素生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)值、減少廢物、廢水排放的一條有效途徑。目前發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)化產(chǎn)生磷霉素能力的微生物包括真菌、放線菌、細(xì)菌等，絕大多數(shù)是將磷霉素生產(chǎn)的原料順丙烯磷酸轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素［4-6］，但產(chǎn)量很低，只有1.15 mg/mL［7-8］，且底物投料量有待提高，成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化學(xué)合成法，故未被廣泛采用。另一方面，對(duì)于化學(xué)法產(chǎn)生的廢棄物右旋磷霉素手性轉(zhuǎn)化的報(bào)道很少，張雪姝等［9］以右旋磷霉素為底物，對(duì)東北制藥總廠土樣中菌株進(jìn)行了篩選，最終得到3株細(xì)菌能將右旋磷霉素轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素，但由于菌株自身?xiàng)l件限制，底物投料量和轉(zhuǎn)化率均有待提高。本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道1株能夠?qū)⒂倚酌顾厥中赞D(zhuǎn)化成左旋磷霉素的沙門柏干酪青霉(Penicillium camemberti)2221［10］，在此基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)，不加底物的菌體發(fā)酵液上清中含有能夠手性轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的物質(zhì)，推測(cè)具有生物轉(zhuǎn)化作用的酶為組成型酶類或酶系。本實(shí)驗(yàn)濃縮發(fā)酵上清液后獲得粗酶，對(duì)此酶進(jìn)行固定化條件的摸索研究。與游離酶相比較，利用固定化酶可以很方便地分離產(chǎn)物和重復(fù)使用酶類，有利于提高酶的利用效率，延長(zhǎng)使用時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株右旋磷霉素手性轉(zhuǎn)化菌:沙門柏干酪青霉2221(Penicillium camemberti)，本實(shí)驗(yàn)室保藏;生物檢定菌:藤黃八疊球菌，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，瓊脂20.0 g，馬鈴薯浸汁(去皮馬鈴薯200.0 g，切成塊狀，加蒸餾水1 L煮沸30 min，4層紗布過濾得浸汁)定容至1 L，pH 7.2～7.5;PDB液體培養(yǎng)基:不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器右旋磷霉素(東北制藥總廠)，左旋磷霉素鈉(哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司)，海藻酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為市售分析純?cè)噭?冷凍干燥離心機(jī)FD-1(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備菌株沙門柏干酪青霉在含有0.05%底物PDA斜面培養(yǎng)基活化后，將孢子接種于60 mL裝有玻璃珠的PDB液體種子培養(yǎng)基中，接種量為108個(gè)/瓶，28℃，180 r/min培養(yǎng)24 h;按照10%的轉(zhuǎn)種量轉(zhuǎn)種到含有0.3%葡萄糖的裝有玻璃珠的PDB液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)4 d，2層濾紙抽濾除去菌絲體，冷凍干燥上清液，用生理鹽水溶解粗酶，濃縮倍數(shù)為20倍，制成粗酶液。

1.2.2 固定化酶的制備取粗酶液1 mL，將1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0% (質(zhì)量與體積比)的海藻酸鈉溶液，按照一定粗酶液和海藻酸鈉的配比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)混合均勻，滴入1%、2%、3%、4%、5%、6%(質(zhì)量與體積比)濃度CaCl2溶液制備海藻酸鈉凝膠小球，4℃分別固定2、4、6、8 h，轉(zhuǎn)入0.5%CaCl2溶液4℃過夜，用生理鹽水洗凈，獲得固定化酶小球。

1.2.3 固定化酶條件的優(yōu)化分別以CaCl2濃度(質(zhì)量與體積比)、海藻酸鈉溶液(質(zhì)量與體積比)、酶液∶海藻酸鈉體積比為唯一變動(dòng)因素制備海藻酸鈉凝膠小球，4℃固定6 h，得到固定化酶。反應(yīng)后，測(cè)定相對(duì)轉(zhuǎn)化率，找到最優(yōu)化的固定條件。

1.2.4 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究①溫度對(duì)固定化酶活力的影響:在最優(yōu)固定化條件下，分別考察22、28、33、37、42、50℃對(duì)固定化酶轉(zhuǎn)化率的影響;②pH對(duì)固定化酶活力的影響:在最優(yōu)固定化條件下，分別考察pH 3.0、4.5、5.6、6.2、7.0、7.4、8.0對(duì)固定化酶轉(zhuǎn)化率的影響;③固定化酶反復(fù)利用的穩(wěn)定性:在最優(yōu)固定化條件下，反復(fù)使用同一批次固定化酶進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化，測(cè)定每次轉(zhuǎn)化率。

1.2.5 轉(zhuǎn)化率的測(cè)定①磷霉素濃度與抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［11］:準(zhǔn)確稱取磷霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(相當(dāng)于7.801 mg磷霉素，1 mg C3H5Na2O4P=0.7801mgC3H7O4P，1mg C3H7O4P=1000 u)加入1 mL無菌水，振蕩使之完全溶解，即得10 mg/mL磷霉素鈉溶液，用無菌水分別稀釋成50、100、200、300、500、700、1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。用微量進(jìn)樣器吸取不同濃度的磷霉素鈉稀釋液10 μL，將其加在帶有2層直徑6 mm濾紙片的藤黃八疊球菌平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，測(cè)定抑菌圈直徑，以磷霉素鈉濃度(μg/mL)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑(mm)為縱坐標(biāo)作圖，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線;②轉(zhuǎn)化率的測(cè)定:按照1.2.2制備固定化酶，取等量于1 mL粗酶液的固定化酶加入到10 mL含有0.3%(質(zhì)量與體積比)底物的磷酸緩沖液體系中(pH 6.2)，在28℃下120 r/min振搖培養(yǎng)12 h。取固定化酶轉(zhuǎn)化液10 μL滴加到濾紙片上，進(jìn)行生物檢定，取0.3%底物做陰性對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液中磷霉素含量，以產(chǎn)生的最高磷霉素濃度為轉(zhuǎn)化率100%，其他濃度與之相比較，計(jì)算得到相對(duì)轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果

2.1 磷霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)表明在50～100 μg/mL范圍內(nèi)磷霉素鈉濃度的對(duì)數(shù)和抑菌圈直徑呈線性關(guān)系，線性方程:y=15.272x－16.501(圖1)。

圖1 磷霉素鈉濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard concentration curve of levo-fosfomycin

2.2 固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 CaCl2濃度對(duì)固定化酶活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1%濃度CaCl2溶液制得的凝珠不成形;3%CaCl2獲得的固定化酶的轉(zhuǎn)化率最高;4%以上的CaCl2溶液制得的固定化酶轉(zhuǎn)化率開始降低(圖2)。分析認(rèn)為，海藻酸鈉包埋法主要是基于Ca2+置換海藻酸鈉的Na+，從而形成空間網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，將酶固定在網(wǎng)格其中，過低的CaCl2濃度形成的空間網(wǎng)格過于疏松，不利于酶的固定;過高的CaCl2濃度加大了空間網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)對(duì)酶的擠壓，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低酶的活性，另一方面，過密的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)也會(huì)使底物和酶的接觸變得困難，從而降低酶活。因此，最優(yōu)的CaCl2濃度為3%。

圖2 CaCl2濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.2Effect of CaCl2of different concentration on immobilized enzyme activity

2.2.2 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活力的影響觀察發(fā)現(xiàn)，1%和1.5%的海藻酸鈉形成的小球不成形;3%的海藻酸鈉形成的凝膠小球粒徑均勻，機(jī)械強(qiáng)度好;而4%海藻酸鈉過于粘稠(表1)。當(dāng)海藻酸鈉濃度超過3%時(shí)，形成的凝膠小球壁厚，底物與酶的接觸困難，固定化酶轉(zhuǎn)化率開始下降(圖3)。因此，最優(yōu)的海藻酸鈉濃度為3%。

表1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響Table 1Effect of concentration of sodium alginate on the efficiency of immobilization

圖3 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.3Effect of sodium alginate of different concentration on immobilized enzyme activity

2.2.3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響分別取2、4、6、8 h為固定化酶的固定時(shí)間，轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖4。當(dāng)固定化時(shí)間過短時(shí)，由于Ca2+置換海藻酸鈉的Na+沒有達(dá)到平衡，導(dǎo)致固定化小球網(wǎng)格過大，酶容易游離出來，達(dá)不到固定效果;而固定化時(shí)間過長(zhǎng)即超過6 h時(shí)，形成的小球網(wǎng)格過于緊密，酶和底物的接觸困難，酶活力下降。由圖4可知，固定化時(shí)間為6 h，轉(zhuǎn)化率最高，固定化酶活力最高。

圖4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.4Effect of immobilization time on immobilized enzyme activity

2.2.4 海藻酸鈉溶液和粗酶液的體積比對(duì)固定化酶活力的影響分別選取3%濃度海藻酸鈉溶液與粗酶液的體積比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1制備固定化酶，結(jié)果見圖5。海藻酸鈉與酶液的體積比為2∶1時(shí)酶活力最大;隨著比例增大，酶活力下降。分析認(rèn)為，海藻酸鈉和酶液的體積比變相改變了海藻酸鈉的濃度，比例為1∶1時(shí)，海藻酸鈉濃度變小，形成的凝膠小球形狀不規(guī)則，機(jī)械程度低，酶活力低;比例增大為2∶1時(shí)，海藻酸鈉濃度變相增高，形成的凝膠小球形狀均勻，機(jī)械程度高，酶活力增高，轉(zhuǎn)化率最高，說明此條件下固定化酶的活力最高;當(dāng)比例增加到3∶1和4∶1時(shí)，形成的凝膠小球網(wǎng)格過小，影響酶的催化作用，酶活力下降，因此固定化最優(yōu)條件為3%海藻酸鈉溶液和酶液的體積比為2∶1。

圖5 海藻酸鈉溶液和粗酶液的體積比對(duì)固定化酶活力的影響Fig.5Effect of volume ratio of sodium alginate solution and crude enzyme solution on immobilized enzyme activity

綜合以上結(jié)果，最終確定將3%海藻酸鈉溶液和粗酶液的體積比為2∶1混勻后，滴入3% CaCl2溶液中，固定化6 h，得到的固定化酶活力最高。

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 固定化酶的最適溫度由圖6可知，最佳反應(yīng)溫度為37℃，高于和低于此溫度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降，即固定化酶活力下降。

2.3.2 固定化酶的最適pH由圖7可知，當(dāng)pH 3～6時(shí)，固定化酶轉(zhuǎn)化率變化不大，說明此固定化酶適宜在弱酸條件下催化反應(yīng);超過pH=6則轉(zhuǎn)化率顯著下降，說明固定化酶活力下降，故最佳的pH為6.2。

2.3.3 固定化酶反復(fù)利用的穩(wěn)定性考察了同批次固定化酶多次轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的能力。由圖8可知，隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率逐步降低，在酶反應(yīng)4次后，轉(zhuǎn)化率降低至最初的57.57%。

圖6 溫度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.6Effect of temperature on immobilized enzyme activity

圖7 pH對(duì)固定化酶活力的影響Fig.7Effect of pH on immobilized enzyme activity

圖8 使用次數(shù)對(duì)固定化酶的影響Fig.8Effect of used times on immobilized enzyme activity

3 結(jié)論與討論

本文采用海藻酸鈉作為載體進(jìn)行固定化，具有操作簡(jiǎn)便、材料易得、安全性能高等優(yōu)點(diǎn)。通過單因素分析，最終確定將3%海藻酸鈉溶液和20倍濃縮酶液按照體積比為2∶1混合后，滴入3% CaCl2溶液中，固定化6 h制備固定化酶酶活力最高。該固定化酶最適pH 6.2，最適溫度37℃，最高轉(zhuǎn)化率為14.3%，連續(xù)反應(yīng)4次后，依然保存57.57%酶活性。

從前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，手性轉(zhuǎn)化右旋磷霉素的酶為一種胞外酶，但該酶是一種有多個(gè)活性中心的多功能酶，還是由一組酶組成的酶系，尚不清楚。根據(jù)文獻(xiàn)研究，Itoh等［6］從土壤中篩選得到15株需氧型細(xì)菌和2株放線菌可以轉(zhuǎn)化順丙烯磷酸為左旋磷霉素，通過加入不同的底物和輔酶，發(fā)現(xiàn)上述活性菌細(xì)胞裂解液中含有某種活性物質(zhì)，可以將順丙烯磷酸轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素，證明為依賴于NAD(P)H的單加氧酶的環(huán)氧化作用。另Liu P等［12］發(fā)現(xiàn)菌株Streptomyces wedmorensis產(chǎn)生的2-羥基丙基磷酸環(huán)氧化酶，可以將2-羥基丙基磷酸環(huán)氧化為磷霉素，此過程需要Fe2+和NAD (P)H才能實(shí)現(xiàn)。因此推測(cè)，從沙門柏干酪青霉菌2221發(fā)酵上清中提取的粗酶，在將右旋磷霉素手性轉(zhuǎn)化成左旋磷霉素的過程中，很可能是需要輔基參與的由多個(gè)酶催化的開環(huán)和環(huán)氧化反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著固定化小球利用次數(shù)的增多，酶的轉(zhuǎn)化能力下降，即酶活力下降。這部分原因可能是由于該酶的輔基會(huì)從小球中逐漸游離出來，從而使酶活性喪失，轉(zhuǎn)化率降低，這種推測(cè)還需要進(jìn)一步深入的實(shí)驗(yàn)研究。但此酶是一種胞外酶，粗酶易于分離;且生產(chǎn)菌為真菌，0.3%底物濃度下對(duì)其無生長(zhǎng)抑制作用，培養(yǎng)簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，并具有直接將右旋磷霉素轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素的作用，避免右旋磷霉素工業(yè)污染，變廢為寶，具有工業(yè)應(yīng)用的前景。

［1］Hendlin D，Stapley E O，Jacksen M，et al.Phosphonomycin:A new antibiotic produced by strains of Streptomyces［J］.Science，1969，166(3901):122-123.

［2］Falagas ME，Giannopoulou K P，Kokolakis G N，et a1.Fosfomycin:use beyond urinary tract and gastrontestina1 infections.［J］.ClinInfect Dis，2008，46(7):1069-1076.

［3］Christensen BG，Leanza WJ，Beattie TR，et al.Phosphonomy-cin:structure and synthesis［J］.Science，1969，166(3901): 123-125.

［4］盧法章，馮麗艷，劉輝.磷霉素的生物合成［J］.遼寧醫(yī)藥，2000，15(4):1-3.

［5］White R F，Birnbaum J，Meryer R T.Microbial epoxidation of cis-propenylphosphonic to(－)-cis-1，2-epoxyprepylphosphonic acid［J］.Applied Microbiology，1971，22(1):55-60.

［6］Itoh N，Kusaka M，Hirota T，et al.Microbial production of antibiotic fosfomycin by a stereoselective epoxidation and its formation mechanism［J］.Applied Microbiology Biotechnology，1995，43(3):394-401.

［7］閆浩林，馬莉，徐威.利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)磷霉素的研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，12(1):32-40.

［8］閆浩林，馬莉，張秋霞.固定化小棘青霉生產(chǎn)磷霉素的研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，11(4):282-288.

［9］張雪姝，徐慧，張穎.以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株篩選方法［P］.中國(guó)，2006，申請(qǐng)?zhí)? 200610046425.1.

［10］孫楊，孫東陽，姜平，等.右旋磷霉素手性轉(zhuǎn)化菌株的篩選與鑒定［J］.中國(guó)抗生素雜志，已接收.

［11］孫東陽，孫楊，姜平，等.右旋磷霉素手性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測(cè)方法的建立［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(4):44-47.

［12］Liu P，Liu A，Yan F，et al.Biochemical and spectroscopic studies on(s)-2-hydroxypropylphosphonic acid epoxidase:A novel mononuclear non-heme iron enzyme［J］.Biochemistry，2003，42 (40): 11577-11586.

Chiral Transformation of Dextral-Fosfomycin by Enzyme Immobilization Method

JIANG Ping，SUN Yang，SUN Dong-yang，ZHANG Yi-xuan
(Sch.of Life Sci.＆Bio-Pharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang，110016)

Study confirmed that Penicillium camemberti(PC)2221 produced an extracellular enzyme that chirally transformed dextral-fosfomycin to levo-fosfomycin.The optimal conditions of immobilized enzyme(IE)using sodium alginate as carrier were studied.The optimum conditions for immobilization and characteristic of the IE were investigated，including concentrations of sodium alginate and CaCl2，the best conditions for reaction such as pH，temperature，and the stability of repeatedly uses.The results showed that the optimal conditions of the immobilization was 3%(w/ v)sodium alginate solution，3%(w/v)CaCl2solution，the volume ratio 1∶2 of sodium alginate solution(3%w/v) and crude enzyme solution(concentrated 20 times)，6 h immobilization time.The optimal pH and temperature of the IE were pH 6.2 and 37℃with the transformation rate at 14.3%.When reacted for four times continuously，the transformation rate was 57.57%of the initial one.The enzyme produced by PC 2221 could immobilize by sodium alginate at the optimal condition，and the IE could chirally transform dextral-fosfomycin to levo-fosfomycin to improve its utilization ratio and extent its life and possessed further study on the development value.

levo-fosfomycin; dextral-fosfomycin;biotransformation;immobilization;sodium alginate

Q949.327.1

A

1005－7021(2011)01－0051－06

遼寧省教育廳高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2008T190)

姜平女，碩士。研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。E-mail:muyi232377@163.com

*通訊作者。E-mail:zhangyxzsh@163.com

2010-12-14;

2011-01-21