大菱鲆親魚、配子和仔稚魚的質(zhì)量評價

馬愛軍, 雷霽霖, 王新安, 黃智慧, 丁福紅

（中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室, 山東 青島 266071）

大菱鲆親魚、配子和仔稚魚的質(zhì)量評價

Quality assessment of broodstock, sperm, egg, oosperm and larva of turbot （Scophthalmus maximus L.）

馬愛軍, 雷霽霖, 王新安, 黃智慧, 丁福紅

（中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室, 山東 青島 266071）

自 1992年大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）被引入中國以來, 在海水魚類工廠化養(yǎng)殖領(lǐng)域取得了重大成效[1]。近年來, 引進的大菱鲆在中國種質(zhì)退化現(xiàn)象較為嚴重[2]。調(diào)研表明, 在2000～2001年大菱鲆苗種經(jīng)10個月的養(yǎng)成有30%可達到上市規(guī)格, 現(xiàn)在養(yǎng)成10個月能達到上市規(guī)格的不到10%, 整批苗種達到上市規(guī)格要在18個月以上, 甚至2 a。為促進中國大菱鲆健康、穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展, 科研人員對其進行了一些列良種選育及繁育優(yōu)化研究。在此過程中,依據(jù)一定的科學標準選擇優(yōu)良的親魚、精子、卵子、受精卵和仔稚魚是極其重要的。多年來, 盡管國外對大菱鲆親魚、精子、卵子、受精卵和仔稚魚的質(zhì)量評價方法、尤其對精子和卵子的評價方法從不同的角度進行了探討, 并根據(jù)所采用的指標得出相應的質(zhì)量評估參數(shù)。但目前尚未有統(tǒng)一的標準應用到實際生產(chǎn)。作者分別詳細綜述了國內(nèi)外大菱鲆親魚、精子、卵子、受精卵和仔稚魚質(zhì)量評估方法及其相應的評估參數(shù), 以期為在大菱鲆繁育（選育）過程中選擇質(zhì)量優(yōu)良的親魚、精子、卵子、受精卵和仔稚魚提供參考依據(jù)。

1 親魚質(zhì)量評價

對親魚質(zhì)量評估的研究主要集中于雌魚, 通常采用的直接指標是雌性親魚的繁殖力和產(chǎn)卵量。Jones[3]估算, 每年大菱鲆雌性親魚的排卵量為3×105個/kg, 繁殖力（卵母細胞數(shù)）為 106個/kg。Howell等[4]在兩個連續(xù)繁育季節(jié)對5尾雌大菱鲆（3～5 kg）的產(chǎn)卵狀況進行研究, 發(fā)現(xiàn)每年相對繁殖力范圍是285～463 g/kg, 在研究范圍內(nèi)繁殖力和體質(zhì)量不相關(guān)。根據(jù)Fauvel等[5]所報道的“大菱鲆人工繁育技術(shù)”中雌性親魚繁殖力的演變資料估算, 兩組大菱鲆雌魚在連續(xù) 4 a（1988～1991年）繁殖力平均值的范圍分別是 7.0×104～1.3×105和 5.9×104～1.3×105個/kg; 4 組大菱鲆雌魚在連續(xù) 3 a（1989～1991年）繁殖力平均值的范圍分別是 2.1×104～1.5×105、1.2×106～3.3×106、6.9×104～2.5×105和 9.5×104～1.7×105個/kg; 一組大菱鲆雌魚在連續(xù) 2 a（1990～1991年）繁殖力平均值的范圍是 1.1×105～2.1×105個/kg。Fauvel等[6]研究了通過控制過熟來提高親魚的繁殖能力。

實驗設(shè)計為對不同組別雌魚進行每周檢查 2次和每周檢查5次兩種處理。結(jié)果表明, 除了1個組具有極低的繁殖力（0.95×105個/kg）外, 其余各組繁殖力 基 本 都 相 似 （2.69×105、 3.10×105、 2.89×105、2.87×105、2.64×105個/kg）, 兩種處理的平均繁殖力分別為 2.89×105、2.33×105個/kg。進一步研究發(fā)現(xiàn), 每一種處理中, 兩種處理之間的平均繁殖力都沒有明顯的差異（P＞0.05）; 一個繁殖組每尾魚的產(chǎn)卵數(shù)量與另一個繁殖組每尾魚的繁殖數(shù)量不因處理方法的不同而不同（P＞0.05）。據(jù)此推測, 卵子是否過熟, 對利用繁殖力和產(chǎn)卵量評估親魚質(zhì)量基本上沒有影響。Fauvel 等[5]研究表明, 雄性大菱鲆個體質(zhì)量只有達到0.6 kg以上時, 按摩其腹部才能擠出精液。精液百分比含量隨個體體質(zhì)量的增加而提高。Deniel[7]報道, 雄性大菱鲆的性成熟系數(shù)值（gonadosomatic index, 簡稱GSI）很低, 最高比率只達到接近0.6%。與其他魚類比較, 說明這個比率很低。在大菱鲆精子發(fā)生過程中, 精巢發(fā)育很慢。有關(guān)大菱鲆親魚質(zhì)量評價的研究, 雷霽霖等[8]認為選擇優(yōu)質(zhì)親魚的形態(tài)標準為: （1）體質(zhì)量 2～6 kg, 雌魚 3 kg（3～6 齡）以上, 體長40 cm 以上; 雄魚 2 kg（2～6 齡）以上, 體長 30～35 cm;（2）體型完整無缺、無畸形、活動力強、集群性好、攝食積極。雌、雄兩性親魚性成熟標準為雌魚通過卵巢在腹面突出的程度判斷成熟度。0階段: 不突出;1階段: 卵巢后小葉輕微突出; 2階段: 卵巢后小葉明顯突出, 而前小葉輕微突出; 3階段: 卵巢前后小葉都明顯突出。當雌魚發(fā)育到第3個階段時, 可用手輕擠卵巢, 可見有成熟卵流出。大菱鲆雄魚性腺不明顯,擠壓力度大于雌魚, 可見有精液流出。

2 精子、卵子及受精卵的質(zhì)量評價

2.1 精子的質(zhì)量評價

精子質(zhì)量評價包括常規(guī)的精液檢查方法和近年來發(fā)展起來的一些新技術(shù)檢測手段。常規(guī)檢查方法主要是指精液密度、活力、形態(tài)等方面的判斷, 能夠快速評價精子質(zhì)量; 新技術(shù)檢測手段主要是指計算機輔助精子分析（computer assisted sperm analysis,簡稱 CASA）[9]、流式細胞技術(shù)分析[10]、精子染色的顯微鏡檢測[11]、單細胞凝膠電泳[12]和低滲腫脹[13]等方法, 新技術(shù)檢測方法的建立為快速、多指標、客觀、準確地評價魚類精子質(zhì)量提供了技術(shù)保證。其中, 精液濃度和精子活力是較為常用的兩個指標。Suquet等[14]認為精子濃度可利用血細胞計數(shù)器計數(shù)法、精子比容值法、分光光度推定法進行評估; 精子活力可在議定標度上通過運動細胞的百分比、細胞運動的持續(xù)期或這兩個參數(shù)共同評估。Suquet等[14]利用精液濃度和精子活力這兩個指標對大菱鲆精子質(zhì)量評估的可行性進行了研究。結(jié)果表明, 利用精子比容值法精子濃度不能被精確評估; 利用血細胞計數(shù)器計數(shù)法可以得到精子濃度的精確值, 但這種計數(shù)耗時較長, 對一尾雄魚精子濃度的評估需要 2 h; 利用分光光度測定法在420 nm波長可以精確評估精子的濃度。黏性狀態(tài)精液的濃度（54.6×109個/mL±5.4個/mL）高于液態(tài)精液的濃度（20.0×109個/mL±2.4個/mL）,大菱鲆精液的稀釋倍數(shù)可以影響精子的活力。在1 : 10、1 : 100、1 : 1000 3個稀釋梯度下, 以每30 s為時間間隔對大菱鲆精子的活力進行評估（運動精子的議定標度: 0表示 0%, 1表示 0～25%, 2表示25%～50%, 3表示 50%～75%, 4表示 75%～100%）, 發(fā)現(xiàn)增加稀釋可導致大菱鲆精子活力降低（運動精子的百分比減少及精子運動的持續(xù)期降低）。在自然產(chǎn)卵季節(jié), 對于初次采集的精液, 運用上述方法對其質(zhì)量進行了評估。結(jié)果表明每尾魚提取精液的均值為1.6 mL±0.2 mL, 濃度為 38.3×109個/mL±5.9 個/mL,精子運動持續(xù)期為 6.06 min±1.08 min, 精子比容值為 40.4%±5.8%。對大菱鲆精子活力評價時, 運動精子的議定標度也可參照文獻[15]。即:“0”表示無運動精子, “1”表示有 1%～5%的運動精子, “2”表示有5%～29%的運動精子, “3”表示有 30%～79%的運動精子, “4”表示有 79%～95%的運動精子, “5”表示有95%～100%的運動精子。Suquet等[16]根據(jù)已報道的研究成果詳述了大菱鲆精子的特征, 并與部分淡水及海水魚類的精子特征進行了比較。大菱鲆 GSI值是很低的, 僅為0.6%～0.8%。每尾魚每次提取精液的均值為 0.2～2.2 mL, 濃度為 0.7×109～11.0×109個/mL,每次提取得到的精子總量為 0.2×109～12.0×109個精子, 和大多數(shù)淡水魚相比, 大菱鲆精子運動的持續(xù)期較長為 1～17 min。大菱鲆精子的正常形態(tài)被認為是一種原始的類型, 借助電子顯微鏡觀察, 發(fā)現(xiàn)大菱鲆精子與其他已報道的大多數(shù)真骨魚精子相類似。精子總長度大約為 45 μm, 精子頭部為圓形（最大直徑為1.7 μm）沒有頂體。細胞核的前、后部呈現(xiàn)凹陷, 中間室出現(xiàn)萎縮, 聚集呈環(huán)狀物的 10個線粒體經(jīng)常是可計數(shù)的。等離子膜圍繞著鞭毛的近端, 形成“紗罩”, 鞭毛呈現(xiàn)典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)。Suquet等[17]研究了光周期、擠魚的頻率以及雌魚的存在對大菱鲆精液產(chǎn)量的影響, 其相關(guān)數(shù)據(jù)可為大菱鲆精子質(zhì)量評估提供借鑒。研究結(jié)果表明改變光周期對精液產(chǎn)量沒有影響, 在試驗期間每尾魚總精液產(chǎn)量均值為 4.9 mL±0.9 mL, 平均精液濃度為 29.4×109個/mL± 2.8×109個/mL。在第二次自然排卵結(jié)束, 盡量刺激精液產(chǎn)生或?qū)е箩尫诺土康木? 結(jié)果得到平均精子濃度和平均精子活力分別為 47.6個/mL±10.2×109個/mL 和 2 min36 s±0 min47 s, 擠魚的頻率對精液總量、平均精子活力沒有影響, 在自然產(chǎn)卵時期雌魚的存在可以提高精子的活力。實驗結(jié)果為從3 min27 s±0 min52 s提高到 6 min38 s±1 min28 s。Geffen等[18]認為在對精子質(zhì)量的描述方面盡管精子濃度、精子運動、受精率之間的關(guān)系并不直觀, 但這些參數(shù)仍然是評估精子質(zhì)量最常使用的指標。為了界定大菱鲆精子質(zhì)量, Geffen等[18]利用運動精子的百分比、精子運動的保持力、溫度對精子運動保持力的影響、三磷酸腺甙（adenosine triphosphate, 簡稱ATP）濃度對精子運動保持力的影響等 4個參數(shù)對其進行了研究。結(jié)果表明, 來源于不同雄魚的精子被激活初期, 運動精子的百分比是34.8%～97.6%, 均值為76.3%, 精子激活1 h后, 均值降低為48.1%, 同時保持運動的精子是激活初期運動精子的 27%～90%, 均值為 62.6%; 在?27℃下冷休克對激活初期精子的運動影響不大, 但激活 30 min后影響顯著（P＜0.05）,冷凍樣品保持運動的精子僅是激活初期運動精子的8.6%（范圍: 0～25%）, 而對照組保持運動的精子是激活初期運動精子的49%（范圍: 38%～63%）, 冷凍樣品和對照組之間差異極其顯著（P＜0.001）; 大菱鲆精子的ATP濃度變化范圍是（0.02～1.35） mg /106精子（均值: 0.46 mg /106精子, 相當于9.2 nmol/108精子）, 激活后運動精子的百分比以及精子激活后運動的保持力和來至非激活精子的 ATP數(shù)量之間的相關(guān)性不顯著（P＞0.05）, 根據(jù) ATP濃度的 3個水平（1=高≥ 1.0 mg /106精子, 2=中=（0.9～0.1） mg /106精子, 3=低≤0.1 mg/106精子）將來自不同雄魚的精子分級, 可發(fā)現(xiàn)一定的變化趨勢, 在精子激活后的任何時刻, 高 ATP水平的運動精子的百分比顯著性地減少, 然而, 運動下降的比率可能和ATP水平有關(guān), 因為ATP越低水平運動減少地越快。魚類精子被激活后對其進行生化變化的密切調(diào)查是非常有意義的一項工作。Suquet等[14]指出大菱鲆精子運動的持續(xù)期可能僅有5 min。Barton[19]報道大菱鲆精子在激活后 3, 15和28 min, 受精能力分別為97%、94%和22%。盡管以運動精子的百分比和精子運動的持續(xù)期為指標對大菱鲆精子質(zhì)量進行了評估[18], 然而 Chauvaud 等[20]認為由于技術(shù)粗糙, 這兩個參數(shù)不可能精確反映精子運動特征。精子運動是評估精子質(zhì)量最常用的參數(shù), 因為精子必須充分運動才能獲得突破卵子的能力。Chauvaud等[20]采用暗視野顯微觀察和頻閃照明-顯像記錄的方法對大菱鲆精子進行觀察, 并對更能體現(xiàn)精子游泳行為的良好參數(shù)如鞭毛波動頻率、游泳速度和精子運動距離進行了測量。結(jié)果表明, 大多數(shù)新采集的精子在激活初期運動精子的百分比為100%, 在激活70～100 s后運動精子的百分比突然下降到 15%～30%; 精子激活后的前 40s鞭毛波動頻率保持50 Hz常數(shù)值, 隨后突然下降到15～30 Hz; 激活后30～40 s期間精子運動速度約為200 μm/s, 激活50 s后下降到100 mm/s的穩(wěn)定值; 精子激活1.2 min后越來越多的精子停止運動; 精子在激活后的1.2 min期間精子運動最小距離的平均值約為 12 mm。根據(jù)上述大菱鲆精子的運動特征可將精子運動分為 4個連續(xù)階段: 階段1, 持續(xù)40 s, 運動精子的百分比較高,鞭毛波動頻率接近50 Hz; 階段 2, 在精子激活后第40秒, 運動精子的百分比突然下降到 30%, 鞭毛波動頻率降為15～30 Hz直到運動結(jié)束; 階段3, 鞭毛末梢變的僵硬; 階段4, 從激活后80 s開始, 越來越多的精子停止運動, 整個鞭毛完全變的僵化。與其他魚類比較, 大菱鲆精子的運動能力是很高的, 這在一定程度上能夠?qū)Υ罅怫倚埕~低GSI值（0.6%）[7]、小的精子釋放體積（最小值～最大值: 0.2 ～2.2 mL）、低精子濃度（0.7×109～11.0×109個/mL）和低精子產(chǎn)量（0.2×109～12.0×109個精子）[18]起到補償作用。Dreanno等[21]研究了尿液對大菱鲆精子質(zhì)量的影響。發(fā)現(xiàn)精子被尿液人工污染后延遲了精子運動的初始時間。利用 CASA技術(shù)對尿液污染精子的運動速度和對照組精子運動速度進行測定, 發(fā)現(xiàn)在 30%被尿液污染的精液中, 精子初始運動 10 s后, 運動速度從 230 μm/s顯著地減小到160 μm /s（P＜0.05）。在精液中添加10%的尿液并混合15 min, 精子初始運動10 s后的運動細胞百分比從83.4%顯著地減小到54.2%。此外, 尿污染對運動參數(shù)的影響隨尿液與精液的混合時間而顯著發(fā)生變化。尿污染后精子的受精率也顯著降低。

2.2 卵子和受精卵的質(zhì)量評價

從形態(tài)上觀察, 大菱鲆卵子呈球狀, 卵徑為0.91～1.20 mm, 卵內(nèi)僅含有一粒油球, 油球徑為0.15 ～0.22 mm[7]。雷霽霖等[23]也對大菱鲆卵子形態(tài)進行研究, 發(fā)現(xiàn)大菱鲆卵呈圓球形, 無色透明, 中央有油球1個, 亦無色透明, 平均卵徑為 0.98 mm, 平均油球徑為0.13 mm。Howell等[4]報道, 大菱鲆卵徑范圍是0.97～1.10 mm, 在每一繁殖季節(jié)期間卵徑存在下降趨勢。評價魚卵的質(zhì)量, 傳統(tǒng)的方法是計算受精率和孵化率。Sahin[24]在實驗室條件下, 對黑海大菱鲆（Psetta maxima）的繁育性能進行研究。發(fā)現(xiàn)在水溫15 ℃條件下, 大菱鲆卵的受精率很低, 僅為 27.6%, 孵化率為74.5%。Fauvel等[5]研究發(fā)現(xiàn), 在產(chǎn)卵受精協(xié)調(diào)一致的情況下大菱鲆卵的平均成活率為 85%, 受精率（受精卵/活卵）大約為68%。然而, 評價成活率存在著主觀性。對于大菱鲆而言, 卵巢以及卵子的pH存在不穩(wěn)定性, 當排卵的時候pH變化較大。當產(chǎn)卵時卵巢的pH為8.2時, 卵的成活率為100%。當pH為7.3時成活率則為 0。卵巢液具有較強的阻斷海水能力,使之形成一個受精的微環(huán)境, 其中包括pH對精子的受精能力和對卵子受精率的影響。卵巢pH的不穩(wěn)定可以作為一種目標參數(shù), 成為搜集部分過成熟卵子狀態(tài)的特征而預告受精成功的可靠因素[5]。Devauchelle等[25]每周按摩1次雌魚腹部采集到卵子的平均受精率為 20%, 而Howell等[4]每天按摩1次雌魚腹部采集到卵子的平均受精率為24%。顯然, 從總體上看, 不同采集頻率對卵的受精率影響不大。對于大菱鲆卵子的質(zhì)量評價, Fores等[22]在對卵子質(zhì)量研究的基礎(chǔ)上, 結(jié)合其他學者的觀點制定了大菱鲆卵子質(zhì)量的鑒定標準（表 1）。對于獲得的批量卵子,根據(jù)以下指標進行選擇孵化: 選擇在階段1和階段2中, 多于 50 mL的上浮卵[16], 顯示了高或中等程度的上浮, 卵徑＜1.1 mm。受精后受精率大于70%, 初次分裂的分裂球較大且對稱率大于50%。Fores等[22]認為卵徑是決定卵子活力的一個重要指標。當卵徑為 0.9～1.1 mm時, 能夠產(chǎn)生比較高的受精率; 卵徑為1.1～1.2 mm時, 可產(chǎn)生中等或比較低的受精率。這一結(jié)果與在其他魚類中比較大的卵徑產(chǎn)生較高比率的受精率和孵化率不同。Fauvel等[6]在研究通過控制過熟來提高親魚的繁殖能力中發(fā)現(xiàn), 大菱鲆卵子的活力與孵化率是正相關(guān)的（r=0.63;P＜0.001）, 因此認為卵子質(zhì)量的評估可由卵子的活力率（活的卵子數(shù)/總卵子數(shù)）來表示。對不同組別雌魚進行每周檢查2次和每周檢查5次兩種處理, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 每天擠卵產(chǎn)生的均活力率（72.56%）顯著高于每周檢查 2次的均活力率（46.62%）（P＜0.01）。據(jù)此推測大菱鲆卵子過熟是導致卵子低活力并最終導致限制仔魚產(chǎn)量的主要原因, 因此應用卵子活力率評估卵子質(zhì)量。為防止卵子過熟, 采卵應在規(guī)范的程序下進行。在對4組雌魚進行每天采卵處理并研究其活力發(fā)現(xiàn), 各組活力率均值分別為59.59%、71.17%、74.42%、83.31%。顯然, 非過熟卵子活力間差異顯著（P＜0.05）。每周檢查 5次處理組的平均孵化率（34.45%）顯著高于每周檢查2次處理組的平均孵化率（11.47%）, 每周檢查2次2組的孵化率為9.88%、16.78%, 而每周檢查5次4組的孵化率分別為 30.02%、31.12%、32.57%、50.46%。Fauvel等[6]研究還發(fā)現(xiàn), 卵子發(fā)展到過熟階段, 活卵子到達仔魚階段的比例減少。這與 Howell等[4]的研究結(jié)果相一致, 他們認為當活力率在 40%左右時, 僅有60%的活卵子被受精。由于了解了這種相關(guān)性, 認為可以通過觀察受精前卵子的形態(tài)特征來預測卵子發(fā)育的潛在可能性,因此限定用孵化單位來預測卵子的質(zhì)量。Omnes等[26]認為一個好的實用的卵質(zhì)量評估標準應該是簡單的。他們利用觀察卵形態(tài)特征和染色檢測技術(shù)對大菱鲆卵質(zhì)量評估方法進行研究, 中性紅（neutral red）（可發(fā)育細胞被染成紅色, 非發(fā)育細胞不能被染成紅色）和臺盼藍（trypan blue）（染料不能滲透可發(fā)育細胞, 死細胞則被染色）兩種染料被使用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)大菱鲆卵的發(fā)育能力率（卵的成活率）約為 70%～85%。作者認為利用中性紅和臺盼藍染料可更好地評估大菱鲆可發(fā)育卵或死卵的比例。Omnes 等[26]認為沒有任何 100%可靠的方法去預測仔魚的飼養(yǎng)潛能。細胞的完整性并非卵質(zhì)量評估的唯一參數(shù), 生化標準和胚胎發(fā)育的環(huán)境條件也應該被考慮。Kj?rsvik等[27]從卵子的形態(tài)標準、受精率和孵化率 3個方面對大菱鲆卵子質(zhì)量進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)良的卵子具有以下特征:（1）形態(tài)標準: 在 8～32細胞期, 標準分裂球百分率為87%～94%; （2）受精率: 以過原腸期計數(shù), 卵的受精率為90%～95%; （3）孵化率: 孵化率為73%～82%。由于卵子的受精率和分裂球的形態(tài)決定著卵子、仔魚、稚魚的存活能力, 因此這 2個指標可以提前預測仔魚的質(zhì)量。由于操作簡單, 卵子的受精率和分裂球的形態(tài)標準通常被應用到海水魚類卵子質(zhì)量的快速評價中。對于上述3個標準, 由于卵裂早期觀察的卵質(zhì)量與其孵化率以及由這些卵孵化出幼體的存活率之間存在顯著的正相關(guān)[28], Kj?rsvik等[29]建議把卵裂早期卵的對稱性（形態(tài)標準）作為評價海水魚卵質(zhì)量的主要指標。這一形態(tài)學評價標準至今仍最具可信性。受精卵的高孵化率和仔魚的高成活率說明來源于親魚的卵的質(zhì)量是優(yōu)良的[23]。Bromage等[30]提出 3個影響卵質(zhì)量的重要因素是卵表面的菌群、親魚營養(yǎng)、卵子的過熟。大菱鲆受精卵呈圓球形, 無色透明, 屬端黃卵, 呈盤狀分裂, 分裂方式與其他硬骨魚類相似。孵化前不久, 胚胎體軀干部色素增多, 尤以背鰭前端和尾部的上、下鰭膜出現(xiàn)的兩叢棕黃色素叢為其標志, 據(jù)此可以判斷卵質(zhì)和胚胎發(fā)育的優(yōu)劣[23]。Sahin[24]對黑海大菱鲆受精卵研究發(fā)現(xiàn), 受精卵呈球型、懸浮、內(nèi)含一油球, 受精卵卵徑為 1.213 mm±0.063 mm。雷霽霖等[8]認為優(yōu)良受精卵的典型特征為透明、渾圓, 卵周隙小。受精后的第1、2次分裂,清晰對稱, 說明此批卵受精率和孵化率高。

表1 大菱鲆卵子質(zhì)量標準[22]Tab. 1 Quality criteria of turbot egg （Scophthalmus maximusL.）[22]

3 仔稚魚的質(zhì)量評價

3.1 仔稚魚質(zhì)量評估的發(fā)育標準

Sahin[24]對黑海大菱鲆研究發(fā)現(xiàn), 初孵仔魚全長2.63～3.33 mm, 均值為 3.12 mm±0.140 mm。卵黃囊均值大小926 μm, 油球直徑243 μm。到初次開口攝食, 全長均值增長到3.44 mm±0.262 mm。仔魚的成活率是對仔魚進行質(zhì)量評估的最直接標準。Fauvel等[5]對來源于 3個池塘的親魚種群后代的成活率進行了統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 3個池塘連續(xù) 3 a（1989～1991年）的成活率依次分別為79%、71.5%、81%, 87%、69.5%、80%, 73.5%、沒有估算、72.5%。Sahin[24]對黑海大菱鲆仔魚存活率研究發(fā)現(xiàn), 孵化后 5日齡仔魚的存活率是 64.52%, 15日齡的存活率是 12.47%,25日齡的存活率是5.48%, 此后, 存活率幾乎變化不大。在整個仔魚期, 即 0～60日齡, 存活率大約為5.2%。大菱鲆早期仔稚魚存活率存在很大差異,Robin[31]報道 27日齡仔魚存活率是 7.5%～8.3%～20.2%（使用 3種不同的富集材料）; Estévez等[32]在45日齡獲得了30%的平均存活率; Olsen等[33]聲稱對于鲆鰈魚類到變態(tài)和餌料轉(zhuǎn)換后（即 80日齡）總體存活率范圍通常是 0～10%; 根據(jù) Witt等[34]報道, 從孵化到餌料轉(zhuǎn)換, 理想的平均存活率范圍是5%～10%。上述 Sahin[24]研究表明, 0～60日齡, 大菱鲆存活率為5.2%, 顯然存活率在正常范圍內(nèi)。雷霽霖等[23]對大菱鲆仔稚幼魚發(fā)育進行了研究。結(jié)果表明, 胚后仔魚階段, 體背部色素逐步增深, 魚體逐漸由透明變?yōu)椴煌该? 由兩側(cè)對稱變?yōu)椴粚ΨQ。3日齡仔魚開口;1～9日齡仔魚, 體色呈紅色, 稱之為“紅苗”; 10～24日齡, 黑色素增多, 稱之為“黑苗”; 25日齡以上, 體披大量花狀色素, 稱之為“花苗”, 由此魚體變寬, 右眼開始上升; 30日齡苗, 右眼已上移至頭頂背部;35～38日齡苗, 右眼已完全轉(zhuǎn)移至左側(cè), 變態(tài)完成而具鲆鰈類所特有的形態(tài)、生態(tài)和生理狀態(tài)。

3.2 仔稚魚質(zhì)量評估的生化標準

對于海水魚類仔魚的質(zhì)量評估, 基于生化標準的方法被認為是更有效和更敏感的, 因為攝食體制的變化首先反映在細胞和亞細胞水平, 然后才體現(xiàn)在整個有機體[35]。仔魚的RNA、DNA和蛋白質(zhì)含量是經(jīng)常被利用的生化標準[36-41]。Cunha等[42]利用兩種生物多元統(tǒng)計分析的方法（主成分分析-PCA和逐步判別分析-SDA）, 以核苷酸（DNA 和 RNA）和蛋白質(zhì)含量為指標, 評估了大菱鲆仔稚魚（發(fā)育時期小于12～13 d, 苗干質(zhì)量低于200 μg）的營養(yǎng)狀況。結(jié)果表明, 來源于 2種處理的生化資料經(jīng)多元分析將具有特定結(jié)構(gòu)的試驗材料可以分為幾個組。通過甄別每一批試驗材料中仔魚的發(fā)育期和營養(yǎng)狀況, 并將這兩個標準和生化分析（RNA、DNA和蛋白質(zhì)含量）相關(guān)聯(lián)確定了4個組, 即G1、G2、G3、G4, 分別代表營養(yǎng)狀況次理想、最理想、極其缺乏和缺乏 4種情況。經(jīng)逐步判別分析（stepwise discriminant analysis,簡稱 SDA）, 4個組的判別函數(shù)式分別為 G1:Y=?20.5+183.9X1+0.3X2?2.3X3; G2:Y=?52.8+274.6X1+0.3X2?3.2X3; G3:Y= ?84.8+345.6X1?27.5X2?2.2X3; G4:Y= ?30.7+224.6X1?8.1X2-2.3X3。式中,X1、X2、X3分別表示DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量。對于營養(yǎng)和發(fā)育背景不清晰的仔魚個體或仔魚新樣本, 要判斷所歸屬的組別, 只需將仔稚魚個體或仔稚魚新樣本的DNA、RNA和蛋白質(zhì)含量指標, 分別代入上述4組的判別公式, 計算出4個函數(shù)值, 以函數(shù)值最大的判別函數(shù)所對應的組作為所屬組別。

3.3 仔稚魚質(zhì)量評估的細菌環(huán)境標準

Gatesoupe[43]認為對魚類仔稚魚的質(zhì)量評價除了發(fā)育標準和生化標準外, 還應該考慮細菌環(huán)境的影響。他利用7批孵化后1～10 d大菱鲆仔稚魚, 通過對10日齡稚魚魚的成活率和平均體質(zhì)量、8日齡稚魚分別在Petrifilm干膜和TCBS瓊脂上的細菌數(shù)以及9日齡稚魚分別在弧菌NP、弧菌P、無弧菌感染3種條件下48 h內(nèi)成活率的統(tǒng)計對大菱鲆仔魚質(zhì)量的早期評估方法進行研究。結(jié)果表明, 10日齡稚魚的平均成活率為 66%, 其中第 2批稚魚的成活率最低,僅為30%, 第5批稚魚的成活率最高, 為95%; 10日齡稚魚的總體平均體質(zhì)量為0.57 mg, 其中第2批均質(zhì)量最低為0.37 mg, 第4批均質(zhì)量最高, 為0.70 mg;8日齡稚魚在 Petrifilm干膜上平均細菌數(shù)目是11×104CFU/仔魚, 其中第一批仔魚的菌數(shù)均值最低,為 2×104CFU/仔魚, 第 7批菌數(shù)均值最高, 為2×105CFU/仔魚; 對同批次仔魚, 在 TCBS霍亂弧菌（Vibrio cholerae）培養(yǎng)基上弧菌 NP的數(shù)目范圍是3×103～3×104CFU/仔魚, 均值為 17×103CFU/仔魚; 9日齡稚魚在弧菌NP、弧菌P、無弧菌感染（對照組）3種條件下48 h內(nèi)的平均成活率分別為82%、46%和80%, 其中在弧菌P感染條件下, 第二批稚魚的成活率最低, 僅為 0.7%, 第 6批稚魚的成活率最高, 為85%。稚魚在弧菌NP和無弧菌感染兩種條件下的成活率的相關(guān)性極高（相關(guān)系數(shù)r=0.93）, 在當前試驗條件下弧菌 NP對大菱鲆仔稚魚的存活不存在有害作用, 而弧菌P對仔稚魚則有顯著影響。顯然, 通過弧菌NP感染仔稚魚進行質(zhì)量評價意義不大。在仔稚魚非感染條件下, 成活率、平均體質(zhì)量、細菌數(shù)目等常規(guī)標準間不相關(guān), 只有在細菌感染條件下, 上述標準間才存在相關(guān)。通過對仔稚魚進行感染試驗, 可以揭示仔稚魚質(zhì)量所隱藏的內(nèi)在特征。

[1] 馬愛軍, 王新安, 雷霽霖, 等. 大菱鲆（Scophthalmus maximus）四個不同地理群體數(shù)量形態(tài)特征比較[J].海洋與湖沼, 2008, 39（1）: 24-29.

[2] 王新安, 馬愛軍, 許可, 等. 大菱鲆幼魚表型形態(tài)性狀與體重之間的關(guān)系[J]. 動物學報, 2008, 54（3）:540-545.

[3] Jones A. Sexual maturity, fecundity and growth of the turbotScophthalmus maximusL[J]. J Mar Biol Ass U K,1974, 54: 109-125.

[4] Howell R, Scott A P. Ovulation cycles and post-ovulatory degradation of eggs of the turbot（Scophthalmusmaximus（L.））[J]. Rapports et proces-Verbaux de la Réunion du Conseil Internationale pour l, Exploration de la Mer, 1989, 191: 21-26.

[5] Fauvel C, Omnes M H, Mugnier C, et al. La reproduction du turbot: aspects biologiques et gestion des reproducteurs[J]. La Pisciculture Francaise, 1993, 112:23-29.

[6] Fauvel C, Omnes M H, Squet M, et al.Enhancement of the production of turbot,Scophthalmus maximus（L.）,larvae by controlling overripening in mature females[J].Aquaculture and Fisheries Management, 1992, 23:209-216.

[7] Deniel C. Les poissons plats en baie de Douarnenez.Reproduction, croissance et migration des Bothidac,Scophthalmidae, Pleuronectidae et Soleidae[J]. Thèse dr, Univ Bretagne Occidentale, Brest, 1981, 22: 476.

[8] 雷霽霖. 海水魚類養(yǎng)殖理論與技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005: 524-591.

[9] Kime D E,Van Look K J, Mc Allister B G, et al. Computer-assissted sperm analysis （CASA） as a tool for monitoring sperm quality in fish[J]. Comp Biochem Physiol, 2001, 130C: 425-433.

[10] Baulny B O, Vern Y L, Kerboeuf D, et al. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in freshand cryopreserved rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） spermatozoa[J]. Cryobiology, 1997, 34: 141-149.

[11] Rurangwa E, Volckaert F A M, Huyskens G, et al.Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assissted sperm analysis （CASA）,viable staining and standardized fertilization in African catfish （Clarias gariepi nus）[J]. Theriogenology, 2001,55: 751-769.

[12] Zilli L, Schiavone R, Zonno V, et al. Evaluation of DNA damage inDicentrarchus labraxsperm following cryopreservation[J]. Cryobiology, 2003, 47:227-235.

[13] Krasznai Z, Marian T, Balkay I, et al.Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp （Cypri nus carpioL . ） sperm induced by hypoosmotic shock[J]. Aquaculture, 1995, 129:134.

[14] Suquet M, Omnes M H, Normant Y, et al.Assessment of sperm concentration and motility in turbot （Scophthalmus maximus）[J]. Aquaculture, 1992, 101: 177-185.

[15] Trippel E A. Estimation of male reproductive success of marine fishes[J]. J Northw Atlantic Sci, 2003, 33:81-113.

[16] Suquet M, Billard R, Cosson J, et al. Sperm features in turbot （Scophthalmus maximus）: a comparison with other freshwater and marine fish species[J]. Aquat Living Resour, 1994, 7:283-290.

[17] Suquet M, Omnes M H, Normant Y, et al. Influence of photoperiod, frequency of stripping and presence of females on sperm output in turbot,Scophthalmus maximus（L.）[J]. Aquaculture and Fisheries Management, 1992, 23: 217-225.

[18] Geffen A J, Frayer O. Retention of sperm motility in turbot,Scophthalmus maximusL.: the effects of time from activation, thermal shock and adenosine triphosphate levels[J]. Aquaculture and Management, 1993, 24:203-209.

[19] Barton L. Egg-Quality of Turbot （Scophthalmus maximusL.） Kept in Captive Conditions （Unknown Bind-ing）[D]. UK: University of Liverpool, 1981, 129.

[20] Chauvaud L, Cosson J, Suquet M, et al. Sperm motility in turbot,Scophthalmus maximus: initiation of movement and changes with time of swimming characteristics[J]. Environmental Biology of Fishes, 1995, 43:341-349.

[21] Dreanno C, Suquet M, Desbruyéres E, et al. Effect of urine on semen quality in turbot （Psetta maxima）[J].Aquaculture, 1998, 169: 247-262.

[22] Fores R, Iglesias J, Olmedo M, et al. Induction of spawning in turbot （Scophthalmus maximusL.） by a sudden change in the photoperiod[J]. Aquacultural Engineering, 1990, 9（5）: 357-366.

[23] 雷霽霖, 馬愛軍, 劉新富, 等. 大菱鲆（Scophthalmus maximusL.） 胚胎及仔稚幼魚發(fā)育研究[J]. 海洋與湖沼, 2003, 34（1）: 9-18.

[24] Sahin T. Larval rearing of the Black Sea turbot,Scopthalmus maximus,under laboratory conditions[J].Turkish Journal of Zoology, 2001, 25: 447-452.

[25] Devauchelle N, Alexandre J C, Le Corre N, et al.Spawning of turbotScophthalmus maximusin captivity[J]. Aquaculture, 1988, 69: 159-184.

[26] Omnes M H, Dorange G, Suquet M, et al. Application of staining techniques to improve the viability assessment of turbot （Psetta maxima） ova[C]//Norberg B.Proceedings of the 6th International Symposium on the Reproductive Physiology of Fish, Bergen, Norway, July 4-9, 1999.Norway: International Symposium on the Reproductive Physiology of Fish, 2000, 6: 435.

[27] Kj?rsvik E, Hoehne-Reitan K, Reitan K I. Egg and larval quality criteria as predictive measures for juvenile production in turbot （Scophthalmus maximusL.）[J].Aquaculture, 2003, 227: 9-20.

[28] Shields R J, Brown N P, Bromage N R. Blastomere morphology as a predictive measure of fish eggviability[J]. Aquaculture, 1997, 155: 1-12.

[29] Kj?rsvik E, Mangor-Jensen A, Holmefjord I. Egg quality in fishes[J]. Advances in Marine Biology, 1990, 26:71-113.

[30] Bromage N, Bruce M, Basavaraja N, et al. Egg quality determinants in finfish: the role of overripening with special reference to the timing of stripping in the Atlantic halibutHippoglossus hippoglossus[J]. J World Aquacult Soc, 1994, 25（1）: 13-21.

[31] Robin J H. Use of borage oil in rotifer production and Artemia enrichment: effect on growth and survival of turbot （Scophthalmus maximus） larvae[J]. Aquaculture,1998, 161: 323-331.

[32] Estévez A, McEvoy L A, Bell J G, et al. Growth,survival, lipid composition and pigmentation of turbot（Scophthalmus maximus） larvae fed live-prey enriched in arachidonic and eicosapentaenoic acids[J]. Aquaculture, 1999, 180: 321-343.

[33] Olsen Y, Evjemo J O, Olsen A. Status of the cultivation technology for production of Atlantic halibut （Hippoglossus hippoglossus） juveniles in Norway/ Europe[J].Aquaculture, 1999, 176: 3-13.

[34] Witt U, Quantz G, Kattner G. Recent development in turbot （Scophthalmus maximus） hatcheries: design and operation[C]// Efficiency in aquaculture: technology improvements in farming systems, proceedings of the 4th international conference on aquafarming “Aquacultura 88” Italy: Verona, 1988: 14-15.

[35] Robinson S M C, Ware D M. Ontogenetic development of growth rates in larval Paci fi c herring,Clupea harengus pallasi, measured with RNA-DNA ratios in the Strait of Georgia, British Columbia[J]. Can J Fish Aquat Sci, 1988, 45: 1 422-1 429.

[36] Canino M F. Effect of temperature and food availability on growth and RNA/DNA ratios of walleye pollockTheragra chalcogramma（Pallas） eggs and larvae[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 1994, 175: 1-16.

[37] Takii K, Seoka M, Takaoka O, et al. Chemical composition, RNA and DNA contents, and alkaline phosphatase activity and growth of striped jack larvae through juveniles[J]. Fish Sci, 1994, 60: 73-76.

[38] Clemmesen C, Sanchez R, Wongtschowski C. A regional comparison of the nutritional condition of SW Atlantic anchovy larvae,Engraulis anchoita, based on RNA/DNA contents[J]. Arch Fish Mar Res, 1997, 45: 17-43.

[39] Gronkjaer P C, Clemmesen C, John M S. Nutritional condition and vertical distribution of theBaltic codlarvae[J]. J Fish Biol, 1997, 51A: 352-369.

[40] Ch?′charo M A, Ch?′charo L, Valdez L, et al. Estimation of starvation and diel variation of the RNA/DNA ratios in fi eld-caughtSardina pilcharduslarvae off the north of Spain[J]. Mar Ecol Prog Ser, 1998, 164:273-283.

[41] Bergeron J. Effect of strong winds on the nutritional condition of anchovy （Engraulis encrasicolusL.） larvae in the Bay of Biscay, Northwest Atlantic, as inferred from an early fi eld application of the DNA/C index[J]. ICES J Mar Sci, 2000, 57: 249-255.

[42] Cunha I, Saborido-rey F, Planas M. Use of multivariate analysis to assess the nutritional condition of fish larvae from nucleic acids and protein content[J]. The Biological Bulletin, 2003, 204: 339-349.

[43] Gatesoupe F J. A method for the early assessment of the quality of turbot larvae[J]. Aquaculture International,1995, 3: 150-154.

（本文編輯: 譚雪靜）

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A

1000-3096（2011）01-0098-07

2010-04-07;

2010-11-12

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目（nycytx-50）; 國家支撐計劃專題項目（2006BAD01A12012）; 農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（nyhyzx07-046）; 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費項目（2009-ts-11）

馬愛軍（1971-）, 女, 山東榮成人, 研究員; 主要從事海水魚類繁育與遺傳育種研究, E-mail:maaj@ysfri.ac.cn;電話:0532-85835103