繁茂膜海綿原細(xì)胞形態(tài)學(xué)識別及分離純化特點(diǎn)

曲 翊, 宋悅凡, 曹旭鵬, 張 衛(wèi),3

（1. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100039; 2. 中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 3. 澳大利亞Flinders大學(xué) 海洋生物過程及生物產(chǎn)品研究中心, 阿德萊德 SA 5042）

繁茂膜海綿原細(xì)胞形態(tài)學(xué)識別及分離純化特點(diǎn)

曲 翊1,2, 宋悅凡1,2, 曹旭鵬2, 張 衛(wèi)2,3

（1. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100039; 2. 中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 3. 澳大利亞Flinders大學(xué) 海洋生物過程及生物產(chǎn)品研究中心, 阿德萊德 SA 5042）

利用透射電鏡對繁茂膜海綿（Hymeniacdidon pelevis）的原細(xì)胞進(jìn)行觀察, 確定其超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為:細(xì)胞核大, 核仁顯著。細(xì)胞質(zhì)中富含線粒體和處于不同消化階段的溶酶體。對繁茂膜海綿本體和芽體旺盛分生組織進(jìn)行觀察, 發(fā)現(xiàn)原細(xì)胞在不同組織中形態(tài)多變。同時(shí)針對不同部位分別進(jìn)行組織離散和原細(xì)胞富集, 結(jié)果證明不同來源的富集原細(xì)胞團(tuán)在原細(xì)胞比例和生長分化過程中都存在差異。

繁茂膜海綿（Hymeniacdidon pelevis）; 原細(xì)胞

海綿是海洋中最低等的多細(xì)胞動物, 近年來從海綿中發(fā)現(xiàn)了大量的生物活性物質(zhì), 使海綿成為了海洋藥物研究中重要的藥源生物[1]。為解決在海綿藥物開發(fā)過程中的生物量供給問題, 近10年來國際上開展了一系列研究以解決海綿資源供給不足問題。海綿細(xì)胞離體培養(yǎng)因其可能利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的代謝調(diào)控, 從而可能實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的大規(guī)?？煽厣a(chǎn), 成為近年來無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[2]。

海綿沒有組織和器官的分化, 不同類型的細(xì)胞能保持功能和結(jié)構(gòu)上的相對獨(dú)立。目前可以確定的細(xì)胞類型有上皮細(xì)胞（epithelial cells）、吞噬細(xì)胞（phagocytes）、領(lǐng)細(xì)胞（choanocytes）、膠原細(xì)胞（collencytes）、原細(xì)胞（archeaocytes）等十幾種。做為海綿體內(nèi)的“干細(xì)胞”, 原細(xì)胞是海綿中不可缺少的細(xì)胞類型, 具有低分化、高增殖潛力的特點(diǎn), 是最理想的海綿細(xì)胞離體培養(yǎng)對象[3]。但海綿原細(xì)胞在海綿體內(nèi)數(shù)量少, 形態(tài)多變, 不易確認(rèn), 給細(xì)胞培養(yǎng)工作造成了一定困難。作者采用石蠟切片和透射電子顯微鏡法對中國黃海繁茂膜海綿（Hymeniacidon perlevis）本體組織和芽體中的原細(xì)胞進(jìn)行識別, 并針對海綿不同部位進(jìn)行原細(xì)胞分離純化結(jié)果的比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

繁茂膜海綿采自大連凌水橋黃海海域潮間帶,自然狀態(tài)下為片狀生長。當(dāng)處于生殖準(zhǔn)備階段時(shí), 會改變形態(tài), 出現(xiàn)芽狀生長（圖1）。

圖1 室內(nèi)養(yǎng)殖狀態(tài)下的繁茂膜海綿Fig. 1 Hymeniacdidon pelevisin aquarium

1.2 方法

1.2.1 海綿組織離散及原細(xì)胞富集

制備過程參照Custodio[4]介紹的方法, 根據(jù)繁茂膜海綿自身特征進(jìn)行部分修改, 具體過程為: 室溫條件下, 海綿在天然海水（含 25×10?6CuSO4）中浸泡3～5 h, 同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌。將處理后的海綿切成1 cm左右小塊, 在無鈣鎂海水中振蕩5次, 棄上清,再重復(fù)振蕩5次。

將前處理完畢的組織放入含10 μmol/L EDTA的無鈣鎂海水中, 振蕩5 min, 300目濾網(wǎng)過濾。濾液經(jīng)800 r/min離心5 min 后棄上清, 加入無鈣鎂海水清洗細(xì)胞, 反復(fù)兩次。向混合細(xì)胞中加入無鈣鎂海水并輕輕吹打, 待細(xì)胞混合均勻后靜置12～24 h以進(jìn)行選擇性聚集。將選擇性聚集形成的細(xì)胞聚集體在天然海水中培養(yǎng)以進(jìn)行差速貼壁。24 h后使用含10 μmol/L EDTA的無鈣鎂海水將分布于細(xì)胞聚集體上層的原細(xì)胞離散下來。離散時(shí)間由鏡檢控制。離散后的細(xì)胞液經(jīng)低速離心后再經(jīng) Ficol-泛影葡胺密度梯度離心。收集ρ=1.09 ～ 1.11的細(xì)胞, 由無菌海水稀釋至106個(gè)/mL, 接種培養(yǎng)。

1.2.2 原細(xì)胞電鏡樣品的制備

取 1 mL富集原細(xì)胞樣品。參考 Mannuel的方法[5], 使用 2.5%戊二醛溶液（pH7.4）在室溫下固定2 h。固定后細(xì)胞經(jīng)鋨酸固定、酒精丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂定向包埋。切片經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛染色,由透射電子顯微鏡（JEM-2000EX, JEOL, Japan）觀察。

1.2.3 海綿組織切片的制備

取繁茂膜海綿本體和芽體, 經(jīng)10%甲醛固定30 min后再由5%氫氟酸消化骨針5 h。處理后的樣品經(jīng)梯度脫水、浸蠟后進(jìn)行常規(guī)切片, HE染色, 中性樹膠封片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 原細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

如圖 2所示, 繁茂膜海綿原細(xì)胞在離散狀態(tài)下呈圓形或橢圓形, 在聚集狀態(tài)下細(xì)胞發(fā)生變形。原細(xì)胞與周邊細(xì)胞之間的界限明顯, 細(xì)胞核大, 具有雙層核膜, 核仁顯著。細(xì)胞質(zhì)淡染, 細(xì)胞器多, 富含線粒體及各個(gè)階段的溶酶體。

2.2 海綿本體組織的形態(tài)學(xué)觀察

從海綿本體HE染色的石蠟切片（圖3）中可以看到游離于中膠層的原細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)巨大, 形態(tài)多變,細(xì)胞核與核仁明顯。海綿組織中骨針束（Bundle）含量豐富, 經(jīng)酸消化后可以看到與參與骨針束固定的膠原物質(zhì)。

2.3 海綿芽體的組織形態(tài)學(xué)觀察

圖4是海綿芽體的HE染色結(jié)果, 處于生長狀態(tài)的海綿組織具有較為豐富的變形拖尾細(xì)胞, 該類細(xì)胞正是正在向膠原細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原細(xì)胞, 具有顯著的變形特征: 多為梭形, 拖尾明顯。鏡下觀察表明, 芽體外扁平細(xì)胞層不如本體組織明顯, 有外皮結(jié)構(gòu)。整個(gè)芽體的骨針含量低于本體組織。繁茂膜海綿特征性的骨針束結(jié)構(gòu)（Bundle）在芽體中含量較低。大芽與小芽相比, 骨針含量更低, 組織結(jié)構(gòu)更致密。水溝系統(tǒng)發(fā)育更為完善。

2.4 不同材料來源對原細(xì)胞分離結(jié)果的影響

圖5所示為分離純化各步的原細(xì)胞含量（%）。與本體組織分離純化結(jié)果相比, 采用芽體進(jìn)行細(xì)胞分離純化可以得到更高純度的富集原細(xì)胞。經(jīng)差速貼壁去除上皮和膠原后, 采用兩步法進(jìn)行原細(xì)胞的富集純化: （1）低速離心; （2）密度梯度離心。經(jīng)低速離心純化后, 來源于本體的原細(xì)胞純度為 51.34%, 來源于芽體的細(xì)胞純度為63.58%,T檢驗(yàn)結(jié)果表明, 兩者差異極顯著（P＜0.01）。將低速離心得到的細(xì)胞體系再經(jīng)密度梯度離心法進(jìn)行純化, 可以得到純度更高的富集原細(xì)胞體系。來源于本體的原細(xì)胞純度為72.25%, 來源于芽體的原細(xì)胞純度為80.41%,T檢驗(yàn)結(jié)果表明, 兩者差異顯著（P＜0.05）。

圖3 海綿本體組織Fig. 3 Tissue of Hymeniacdidon pelevis

圖4 海綿芽體Fig. 4 Bud of Hymeniacdidon pelevis

圖5 不同材料來源的原細(xì)胞純化結(jié)果Fig. 5 Purification of archeaocytes from tissue and bud

2.5 不同材料來源對細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響

來源于本體和來源于芽體的原細(xì)胞在成團(tuán)和貼壁分化能力上都存在差異（圖6）。源于本體的細(xì)胞成團(tuán)較小, 易貼壁, 在差速貼壁階段, 細(xì)胞團(tuán)在24 h之內(nèi)全部貼壁鋪展, 光鏡下可見大量上皮細(xì)胞貼壁和原細(xì)胞遷出現(xiàn)象, 細(xì)胞團(tuán)之間也通過膠原和上皮的貼附現(xiàn)象彼此連接。經(jīng)低速離心和密度梯度純化之后, 富集原細(xì)胞成團(tuán)速度較快, 在培養(yǎng)至 72 h出現(xiàn)貼壁分化現(xiàn)象。來源于芽體的細(xì)胞成團(tuán)較大, 但貼壁分化能力較弱。在差速貼壁階段, 細(xì)胞團(tuán)在24 h之內(nèi)全部貼壁, 但具有明顯膠原細(xì)胞遷出現(xiàn)象的細(xì)胞團(tuán)不足50%, 細(xì)胞團(tuán)之間也沒有彼此連接現(xiàn)象。經(jīng)低速離心和密度梯度純化之后, 富集原細(xì)胞成團(tuán)速度快, 細(xì)胞團(tuán)大于來源于本體的細(xì)胞團(tuán)。在培養(yǎng)過程中,細(xì)胞團(tuán)通過彼此匯合達(dá)到體積增大, 在72 h之內(nèi)出現(xiàn)光滑上皮, 但直至培養(yǎng)第 6 天也沒有出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)貼壁現(xiàn)象。

圖6 原細(xì)胞富集體系培養(yǎng)結(jié)果Fig. 6 Primary culture of archeaocytes

3 討論

原細(xì)胞是海綿組織中必不可少的一種細(xì)胞, 被認(rèn)為是海綿體內(nèi)的干細(xì)胞[6], 在海綿生長的不同生理狀態(tài)可以向不同的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化。但海綿組織中的原細(xì)胞較為稀少。只有在特殊的情況下, 例如生殖,出芽, 組織修復(fù)等情況下原細(xì)胞才會聚集于某些區(qū)域[2]。繁茂膜海綿的生長具有周期性, 具有明顯的出芽現(xiàn)象。原細(xì)胞在芽體（bud）與本體（mother sponge）中的不同形態(tài), 表現(xiàn)出原細(xì)胞的形態(tài)多變性。尤其在芽體中由于生長旺盛, 向膠原細(xì)胞分化, 細(xì)胞變形為梭形, 常有膠原拖尾, 是原細(xì)胞向膠原細(xì)胞分化的顯著標(biāo)志。芽體發(fā)育過程起始于細(xì)長的小芽（Filament）。在發(fā)育過程中, 小芽的末端逐漸膨大, 直至形成明顯芽體后隨著斷裂作用脫離本體。游離的芽會尋找合適的附著基, 一旦附著, 便會繼續(xù)發(fā)育成海綿。細(xì)長小芽的組織切片結(jié)果表明, 扁平細(xì)胞層結(jié)構(gòu)不明顯, 小芽內(nèi)部的原細(xì)胞含量多于本體組織。當(dāng)細(xì)長小芽發(fā)育成大芽時(shí), 隨著發(fā)育的成熟, 芽體中的細(xì)胞類型也會發(fā)生顯著變化, 形成以原細(xì)胞為主的細(xì)胞構(gòu)成方式。一個(gè)發(fā)育完全成熟的芽體外皮層被裹在扁平細(xì)胞中, 在外皮層內(nèi)部具有豐富的膠原。

原細(xì)胞具有運(yùn)動性, 同時(shí)具有消化和吞噬功能。通常在領(lǐng)細(xì)胞周圍會匯聚大量原細(xì)胞, 將領(lǐng)細(xì)胞捕獲到的食物進(jìn)行吞噬消化, 以供整個(gè)機(jī)體生長發(fā)育所需。同時(shí)消化后的廢物可以通過原細(xì)胞的胞吐作用經(jīng)水溝系統(tǒng)排出體外。電鏡下觀察到的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可以證明原細(xì)胞強(qiáng)大的吞噬能力: 胞質(zhì)中充滿大量吞噬體及各個(gè)階段的溶酶體。而且, 原細(xì)胞的線粒體數(shù)量多, 可以為吞噬消化過程提供大量能量,使原細(xì)胞在外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的降解和循環(huán)中發(fā)揮重要作用。超微結(jié)構(gòu)證實(shí), 原細(xì)胞的核比例大, 具有明顯核仁, 攜帶大量遺傳物質(zhì), 是一類具有增殖潛能的細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)果證實(shí), 隨著純度增加, 細(xì)胞成團(tuán)速度加快, 證明原細(xì)胞的細(xì)胞活力強(qiáng), 適于進(jìn)行體外培養(yǎng)。不同來源的細(xì)胞體系在細(xì)胞培養(yǎng)中存在明顯差異: 在差速貼附階段, 來源于本體的細(xì)胞體系具有更強(qiáng)的貼壁及遷移能力。這一現(xiàn)象可能與海綿組織中的細(xì)胞比例有關(guān), 光鏡結(jié)果表明繁茂膜海綿具有明顯的外骨骼（Cortex）和典型的扁平細(xì)胞層,由于生長在潮間帶, 風(fēng)浪沖擊作用較強(qiáng), 所以外骨骼連接緊湊, 扁平細(xì)胞數(shù)量多, 細(xì)胞層致密。在差速貼附過程中, 本體由于其扁平細(xì)胞比例高, 更易出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象。而芽體的扁平細(xì)胞層不明顯, 細(xì)胞比例低, 貼壁遷移現(xiàn)象不明顯。隨著原細(xì)胞純度的不斷增加, 細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)律更趨近于小細(xì)胞彼此匯合成大團(tuán),貼壁能力減弱。這可能與原細(xì)胞的分化方向有關(guān), 需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

從本體和芽體分別進(jìn)行細(xì)胞離散純化, 結(jié)果證明從芽體中更易獲得高純度的原細(xì)胞, 而且更易保持其未分化的狀態(tài)。這一結(jié)果可以為原細(xì)胞培養(yǎng)建系提供一條有希望的探索途徑。由于海綿原細(xì)胞的形態(tài)多變, 以往對原細(xì)胞的觀察鑒定一直沒有定論。本文通過同時(shí)對比不同生長狀態(tài)的組織中的原細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征, 對海綿原細(xì)胞的各種存在形態(tài)有所判定, 為深入研究海綿原細(xì)胞提供必要的信息。

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Received: Feb., 25, 2010

Key words:Hymeniacdidon pelevis; archeaocyte

Abstract:Archeaocytes in Hymeniacdidon pelevis were observed by normal light microscope and transmission electron microscope. The results showed that archeaocyte has numerous mitochondria, phagosomes and lysosomes in several stages of digestion. The morphological results show that the shape of archeaocytes changes in different tissues. The cell culture data shows that archeaocytes from different origins have distinguishing difference in growth and differentiation behaviors.

（本文編輯:梁德海）

Histological characterization and purification of archeaocytes of marine sponge Hymeniacdidon pelevis

QU Yi1,2, SONG Yue-fan1,2, CAO Xu-peng2, ZHANG Wei2,3

（1. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China; 2. Marine Bioproducts Engineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China; 3. Flinders Centre for Marine Bioprocessing and Bioproducts, Flinders University, Adelaide SA5042, Australia ）

Q24

A

1000-3096（2011）01-0001-05

2010-02-25;

2010-05-24

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA09Z435）

曲翊（1978-）, 女, 遼寧大連人, 博士研究生, 研究方向?yàn)樯锘? 電話: 0411-84379527, E-mail: qyi@dicp.ac.cn; 張衛(wèi), 通信作者,E-mail: weizhang@dicp.ac.cn