轉(zhuǎn)移因子的質(zhì)量控制及影響因素分析

郭威

（長春理工大學(xué) 計算機(jī)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

轉(zhuǎn)移因子（TF）是可透析的小分子天然生化制劑，屬免疫調(diào)節(jié)性藥物。在激發(fā)人體免疫力的同時，無抗原性，又不產(chǎn)生任何副作用。這是其它大分子量的淋巴因子不可比擬的優(yōu)越性，轉(zhuǎn)移因子具有生物學(xué)和免疫學(xué)特異性的潛力，而且具有蛋白樣的性質(zhì)。

轉(zhuǎn)移因子（TF）是白細(xì)胞浸出液的可透析物質(zhì)中的一種具有免疫活性的小分子成分，其活性是多核苷酸或小肽的復(fù)合物，其主要作用是可以提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能［1］。

在研制人脾轉(zhuǎn)移因子的基礎(chǔ)上，根據(jù)轉(zhuǎn)移因子無種屬特異性的理論，試制了豬脾轉(zhuǎn)移因子并對其理化和生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了檢測。

近年來，由于與疾病尤其是與愛滋病斗爭的迫切需要，使人們認(rèn)識到由于免疫系統(tǒng)功能失調(diào)會引起機(jī)體各種各樣的疾病，世界范圍的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移因子不僅作用于T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、還具有保護(hù)造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞等多種細(xì)胞的功能，同時提高IL-2、IFN和集落刺激因子的多種細(xì)胞因子在體內(nèi)的生成，調(diào)整多項免疫指標(biāo)，作用于免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，增強(qiáng)免疫功能，這就是轉(zhuǎn)移因子對付各種免疫失調(diào)癥的理論根據(jù)，無論在治療病毒、細(xì)菌和霉菌感染、調(diào)節(jié)免疫缺損或免疫機(jī)能亢進(jìn)，免除其它藥物和治療法的副作用，保護(hù)免疫器官正常功能等臨床治療中，轉(zhuǎn)移因子具有廣泛而確切的療效［2］。

TF按性質(zhì)可分為特異性轉(zhuǎn)移因子和非特異性轉(zhuǎn)移因子，按來源可分為人轉(zhuǎn)移因子（TFH）和動物轉(zhuǎn)移因子。特異性轉(zhuǎn)移因子系指用某種特定抗原免疫健康的動物（如豬、牛、羊等）取其動物的血液、脾及淋巴組織作原料，采用非特異性TF的常規(guī)工藝獲得的提取物，是從具有特異抗原的白細(xì)胞中提取的TF，實際上是特定抗原與T細(xì)胞結(jié)合致敏后，從免疫活性淋巴細(xì)胞中釋放出的一種特異性抗原分子物質(zhì)［3］。

TF具有特異性的可誘導(dǎo)性和生物活性。從TF的氨基酸和核酸堿基構(gòu)成的情況來看，主要成分是活性多肽，TF是核苷酸、多肽組成的小分子物質(zhì)，分子量小于10KD，TF沒有種屬特異性。把TF在56℃加熱30min對它的活性成分影響很大，兩種組分的活性在4℃保存兩周都會喪失。

TF的重要性質(zhì)是能夠轉(zhuǎn)移免疫能力，起初認(rèn)為轉(zhuǎn)移因子只能在同屬間轉(zhuǎn)移細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，又能越過遺傳的屏障，所以，用于研究和治療的制品都是用人白細(xì)胞制取，后來，眾多實驗表明，不存在這種屏障，可能只要有白細(xì)胞就會有轉(zhuǎn)移因子了。這些發(fā)現(xiàn)，使以大型家畜以及肉用家畜為來源的TF用于分析和治療疾病成為可能。

轉(zhuǎn)移因子各組分E260/E280比值不同，說明肽與核酸含量的組成有差異，聚丙烯胺凝膠電源經(jīng)顯色后，呈現(xiàn)15條區(qū)帶，TFP經(jīng)水解后，檢測含16種氨基酸，其中以天冬氨酸、谷氨酸和甘氨酸為主。

TF是多核苷酸，多肽及其它成分組成的復(fù)合分子，其活性成分在260nm和280nm波長處有一高比例吸收值，在用原子吸收光譜分析中，測量TF制劑中含有微量K、Na、Mg、Zn等金屬元素。TF活性部分對某些PR和某些磷酸二酯酶敏感，接觸后活性喪失，而對DNA酶、RNA酶卻有抵抗。說明TF是一類屬于蛋白質(zhì)的小分子物質(zhì)，而且TF的臨床應(yīng)用正在廣泛進(jìn)行著［4］。

TF的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到人民的用藥安全，對它的檢定也尤為重要。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：三氯化鐵:鹽酸（天津市耀華化工廠）；三氯醋酸；3.5-二羥基甲苯（上海試劑一廠化學(xué)純）；3.5-二羥基甲苯（Dr.Th.Schuehardt&Co.D-85622 Hohenbrunn分析純）

儀器：低速離心機(jī)（LD4-2）；紫外分光光度計WF2800-D2；PHS-2C型酸度計；自動水分測定儀KF-412A；YB-Ⅱ型澄明度檢測儀；熔點測試儀；轉(zhuǎn)移因子（TF）

1.2 理化性質(zhì)分析［5］

TF為類白色或微黃色的易散團(tuán)塊或粉末，在水中易溶解，（1）蛋白反應(yīng)：用205磺基水楊酸檢查TF制劑是否含有蛋白質(zhì)；（2）鑒別：取本品1支，加水25ml使溶解，取2ml，加水3ml與1%茚三酮-丙酮溶液5ml在70℃水浴加熱5分鐘，冷卻，應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)紫色；（3）澄明度：取本品，加適量水制成每1ml中含1mg的溶液，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定；（4）酸度：取本品，加注射用水制成每1ml中含1mg的溶液，依法檢查，PH值應(yīng)為5.0-7.0；（5）水分：取本品，照水分測定法測定，含水分不得超過3%；（6）吸光值分析：取本品，依法進(jìn)行全波長光譜掃描，記錄OD260、OD280，并計算OD260/OD280；（7）核糖含量：應(yīng)用二羥基甲苯試劑顯色法；（8）多肽含量；Follin-酚法即（Lowry）；（9）核糖紫外光譜測定：用高效液相色譜分析儀

1.3 生物學(xué)性質(zhì)分析［6］

（1）異常毒性試驗：取本品依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

（2）熱源：取本品依法檢查，劑量按家兔體重1Kg注射3ml，應(yīng)符合規(guī)定。

（3）過敏試驗：致敏液的制備：取本品，加滅菌生理鹽水制成每1ml中含2mg的溶液即可。

檢查法：取體重為250-350g的健康豚鼠6支連續(xù)三次，間日腹腔注射致敏液0.5ml，于第一次注射至少為14d和21d，分別靜脈注射同一批號的本品2ml，注射后15min內(nèi)觀察動物不得有連續(xù)干咳、連續(xù)前爪抓鼻、明顯豎毛、四肢發(fā)軟、躺臥、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡等現(xiàn)象。

（4）安全試驗：取體重20g左右的純系小白鼠10只，每只腹腔注射TF制劑0.5ml，觀察2天，看生活力。

（5）無菌：取本品，加滅菌生理鹽水制成1ml中含1mg的溶液，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

（6）活性測定：按照Holzman等的方法，做T細(xì)胞玫瑰花結(jié)試驗，看玫瑰花結(jié)形成率，與對照相比的差異。

依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行了全檢，結(jié)果如下：

2 結(jié)果與討論

以上結(jié)果表明，指標(biāo)均符合TF的質(zhì)量控制范圍，但其中的主要檢定項核糖含量一項同批次之間常出現(xiàn)不穩(wěn)定，結(jié)果相差很多，帶著這個疑問，考察了同一批TF在同樣操作條件下對結(jié)果產(chǎn)生的影響。

表1 理化性質(zhì)分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of physical and chemical property

表2 生物學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果Tab.2 Analysis results of the biological property

2.1 核糖檢定［7］

精密稱取D核糖20mg，，溶于0.31mol/L三氯醋酸，準(zhǔn)確稀釋至100ml為200ug/ml核糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取儲備液2.5ml于25ml容量瓶中，用0.31mol/L三氯醋酸稀釋至刻度，即為標(biāo)準(zhǔn)核糖溶液（20ug/ml）.

操作：

精密量取TF待檢品1ml于試管中，加0.61mol/L三氯醋酸，置沸水浴中水解15分鐘，再吸取水解液0.4ml加0.31mol/L三氯醋酸1.6ml及1%二羥基甲苯2ml，混勻，再置沸水浴中加熱30分鐘，冷卻至試室溫，在650nm波長測定OD值。同時準(zhǔn)確吸取核糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml加0.31mol/L三氯醋酸1ml，混勻，其余操作同樣品。并做空白對照（取2ml0.31mol/L三氯醋酸加1%二羥基甲苯）.

計算：核糖含量（ug/ml）=（樣品OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值）×20×5

其原理是含有核糖的RNA與濃鹽酸及3.5-二羥基甲苯在一起沸水浴中加熱20-40分鐘左右，即得綠色物產(chǎn)生，這是由于RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糖醛，再與3.5-二羥基甲苯作用而顯藍(lán)綠色。

反應(yīng)式如下：

為了考察對核糖的影響因素，我做了對比試驗，即用國產(chǎn)（上海產(chǎn)）和進(jìn)口兩種。

從結(jié)果上看，同批轉(zhuǎn)移因子，用進(jìn)口苔黑酚的核糖含量明顯高于用國產(chǎn)苔黑酚的核糖含量。分析原因，質(zhì)優(yōu)的苔黑酚應(yīng)是白色結(jié)晶狀粉末，進(jìn)口苔黑酚即是。從外觀上看，國產(chǎn)苔黑酚的色澤較進(jìn)口的色澤深，說明國產(chǎn)苔黑酚所含雜質(zhì)較多，但進(jìn)口苔黑酚價格較貴，國產(chǎn)苔黑酚較廉價，為了解決這一矛盾，現(xiàn)采用重結(jié)晶法分離純化國產(chǎn)苔黑酚以保證制品良好的穩(wěn)定性。

表3 二羥基甲苯對兩批轉(zhuǎn)移因子的檢測結(jié)果Tab.3 Two hydroxy toluene for two batch transfer factor test results

2.2 苔黑酚的重結(jié)晶

（1）重結(jié)晶的原理［8］

從有機(jī)反應(yīng)中分離出的固體有機(jī)化合物往往是不純的，其中常夾雜一些反應(yīng)副產(chǎn)物、未作用的原料及催化劑等，必須經(jīng)過精制才能得到純品。重結(jié)晶的原理是利用被精制的物質(zhì)與雜質(zhì)在某種溶劑中溶解度的不同，而使它們分離的。

（2）提純苔黑酚的過程

根據(jù)重結(jié)晶提純原理，選用50%乙醇溶液作溶劑提純苔黑酚，具體步驟如下；在裝有回流冷凝管的100ml錐形瓶中，加入3克粗苔黑酚，加入20ml 50%乙醇和1-2粒沸石，接通冷凝水后，在水浴上加熱至沸，并不時振搖瓶中物，以加速溶解。若所加的乙醇不能使苔黑酚完全溶解，則應(yīng)從冷凝管上端繼續(xù)加入少量的50%乙醇（注意：添加易燃溶劑時應(yīng)先滅去火源）。每次加入乙醇后應(yīng)略為振搖并繼續(xù)加熱，觀察是否可完全溶解，待完全溶解后，再多加幾毫升。滅去火源，移去水浴，稍冷后加入少許火性碳（0.03克左右）并稍加搖動。再重新在水浴上加熱煮沸5-10min。趁熱用預(yù)熱好的無頸漏斗和折疊濾紙過濾，用少量熱的50%乙醇濕潤折疊濾紙后，將上述苔黑酚的熱溶液濾入干燥的100毫升錐形瓶中（注意：這時附近不應(yīng)有明火）。濾完后用少量的50%乙醇洗滌容器和濾紙。盛濾液的錐形瓶用軟木塞塞好，任其冷卻，最后用冷水冷卻。用布氏漏斗抽濾（濾紙應(yīng)先用50%乙醇濕潤，吸緊），用少量50%乙醇洗滌。抽干后將結(jié)晶移至表面皿上，放在干燥器中，待干燥后，測定其熔點，稱重并計算回收率。

重結(jié)晶后，經(jīng)測定，苔黑酚的熔點為55.5-58.5℃，未結(jié)晶前的苔黑酚熔點為55-58℃，干燥后稱重為2.37克，回收率為2.37/3×100%=79%

從結(jié)果上看，重結(jié)晶后的苔黑酚的熔點與未結(jié)晶前的熔點幾乎一致。

（3）國產(chǎn)、進(jìn)口及重結(jié)晶國產(chǎn)苔黑酚后對核糖含量的影響

表4 重結(jié)晶國產(chǎn)苔黑酚、國產(chǎn)苔黑酚、進(jìn)口苔黑酚測定轉(zhuǎn)移因子的核糖含量結(jié)果Tab.4 Recrystallization of domestic orcin，homebred orcin，import orcinol determination of transfer factor RNA content results

由此可見，將國產(chǎn)苔黑酚進(jìn)行重結(jié)晶后，與進(jìn)口苔黑酚同法測得的核糖含量相差無幾，這樣就節(jié)省了大量的檢測費用，可以推廣應(yīng)用。

另外，檢測標(biāo)準(zhǔn)中，測定OD值前不經(jīng)離心即可測定，為了嚴(yán)格控制制品質(zhì)量，現(xiàn)采用測定OD值前離心30分鐘后，再行測定的方法，這樣可以去除制品中賦形劑對測得OD值的干擾，其結(jié)果保證了制品的質(zhì)優(yōu)。現(xiàn)列出兩種情況下的檢定結(jié)果。

表5 離心前后的檢定結(jié)果Tab.5 The results of the test before and after centrifugation

由此可見，制品經(jīng)離心后，核糖結(jié)果稍低于未離心的制品，使檢測的結(jié)果更加真實、可靠。

控制核糖含量的穩(wěn)定性，可從檢測的各個環(huán)節(jié)查找原因，從大量的實踐中得知，在配制FeCl3.HCL溶液過程中，可選用優(yōu)級純化的FeCl3，鹽酸可改用5000毫升/瓶為500毫升/瓶，以減少濃鹽酸的揮發(fā)。

控制核糖的穩(wěn)定性，還是個長期的課題，還需在今后的實踐工作中不斷摸索，逐漸完善。

3 結(jié)論

轉(zhuǎn)移因子的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到人民的用藥安全，不合格品是生產(chǎn)出來的，而不是檢測出來的，制品質(zhì)量必須控制在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，才能保證人民的用藥安全。

為了控制轉(zhuǎn)移因子的核糖穩(wěn)定性，采用重結(jié)晶國產(chǎn)苔黑酚的方法，純化國產(chǎn)苔黑酚，提高其純度，以其替代進(jìn)口苔黑酚，用重結(jié)晶國產(chǎn)苔黑酚與進(jìn)口苔黑酚對比實驗，測得的核糖含量相差無幾，這樣可以減少檢測費用，避免浪費。

測定OD值前，增加離心30分鐘，可以去除制品中賦形劑對測得OD值的干擾，保證了制品的質(zhì)優(yōu)。

改用5000ml/瓶的HCL為500ml/瓶的HCL，選用優(yōu)級品FeCl3.

［1］霍保來.轉(zhuǎn)移因子的研究進(jìn)展［M］.北京：學(xué)術(shù)期刊出版社.

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［5］中華人民共和國衛(wèi)生部.《中國藥典》二部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［6］中華人民共和國衛(wèi)生部.《中國生物制品規(guī)程》一部［M］.北京：中國人口出版社，2000.

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