抑郁狀態(tài)下大鼠海馬Notch1信號系統的改變☆

李元 戴志萍 隋毓秀

近年來抑郁癥海馬神經重塑障礙的發(fā)病假說頗受關注，認為抑郁癥的發(fā)生發(fā)展伴隨著海馬神經重塑功能的障礙，而抗抑郁劑的起效與其逆轉神經再生有關［1］，但其中涉及的信號傳導通路尚不明了。Notch信號通路在成年期動物海馬區(qū)持續(xù)表達，且發(fā)揮促進神經重塑的作用。癲癇、腦缺血等疾病狀態(tài)下，Notch信號系統可以通過調整自身的功能狀態(tài)，調節(jié)神經干細胞的增殖，對成年期中樞神經系統的再生有重要作用［2］。在前期研究中，我們發(fā)現慢性氟西汀干預明顯促進正常大鼠海馬區(qū)的神經再生，同時伴隨Notch1信號通路功能的增強［3］。上述研究提示Notch1信號系統可能在抑郁癥海馬神經重塑障礙中也發(fā)揮了作用。但國內外尚未見相關研究報道。故本研究擬以慢性不可預見的溫和性應激刺激 （chronic unpredictable mild stress，CUMS）和孤養(yǎng)法建立抑郁模型，探討Notch1信號系統是否參與了抑郁癥神經重塑障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠，體重在220～280 g之間。選擇評分相近大鼠約54只，每組18只，隨機分為 3組：CUMS14d組、CUMS28d組和對照組。前兩組按下述方法建立抑郁模型，而對照組大鼠置于另一房間，每籠5只，不接受任何刺激。

1.2 抑郁模型的建立 聯合應用慢性溫和不可預知應激和孤養(yǎng)法建立抑郁模型。慢性不可預見溫和應激刺激（CUMS）按 Banasr［4］方法略改進，具體包括：夾尾、傾斜鼠籠、濕墊、電擊足底、冰水游泳、光照（晝夜顛倒）、禁水、行為限制。CUMS 14 d組和CUMS 28 d組分別接受14 d和28 d的隨機刺激。每日采用一種刺激，同種刺激不能持續(xù)出現，且單籠飼養(yǎng)。

1.3 海馬神經干細胞的增殖、存活和分化 采用免疫組化和免疫熒光法分別檢測海馬齒狀回BrdU陽性細胞數。其中觀察應激對海馬神經干細胞增殖影響的大鼠，在應激最后1 d腹腔連續(xù)注射BrdU；觀察應激對海馬神經干細胞存活和分化影響的大鼠，在應激開始前腹腔注射BrdU。BrdU注射后2 h，戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠。多聚甲醛磷酸緩沖液（PBS）溶液灌注、固定、取腦，海馬連續(xù)冰凍切片，片厚30 μm。BrdU免疫組化標記物：小鼠抗大鼠BrdU抗體（1∶500），生物素化的羊抗小鼠IgG（1∶500），辣根過氧化物酶復合物（1∶100），DAB 顯色劑呈色，封片、鏡檢。BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標標記物：小鼠抗大鼠 BrdU抗體（1∶200），山羊抗小鼠 TRITC（1∶200），兔抗 NeuN 抗體（1∶200）或兔抗 GFAP 抗體（1∶200），山羊抗兔 FITC （1∶200）。

用Nikon CFM-500 E倒置熒光顯微鏡和圖象分析系統進行觀察與分析。采用盲法立體計數法計數海馬齒狀回的BrdU陽性細胞總數。每只大鼠每隔6張選取1張腦片，對海馬齒狀回，計數兩條顆粒細胞層的內側邊界和門區(qū)的BrdU陽性細胞。在400倍和1000倍的光鏡下計數，視野最邊界的細胞不在計數范圍內。計數每張腦切片BrdU陽性細胞數，相加后乘以6即得到每個大鼠海馬齒狀回的總BrdU陽性細胞數目（n＝6）。免疫熒光：每只大鼠統計不少于50個BrdU陽性細胞，以雙標陽性占全部BrdU細胞的比例×100來表示（n＝6）。

1.4 Notch1信號系統相關基因的表達和蛋白水平采用Real time PCR和Western blot法。應激結束后第二天斷頭處死大鼠，快速剝離海馬，機械勻漿后置于-80℃中保存?zhèn)溆?。用Triziol法提取總RNA，然后用逆轉錄酶將mRNA逆轉錄為cDNA。構建聚合酶體系（Premier 5.0設計）及檢測方法詳見參考文獻［3］。海馬組織經蛋白質抽提試劑提取蛋白質，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。4℃封閉過夜，用一抗（rabbit anti-NICD，Hes1，Hes5，Jag1 and Beta-actin antibody，1∶1000，Santa Cruz）室溫孵育 1h，洗膜后加入辣根過氧化物標記的二抗（（anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase，HRP，1∶5000，Santa Cruz）。ECL（增強化學發(fā)光法）顯影，凝膠成像分析系統（上海天能儀器有限公司）進行掃描并記錄光密度強度。蛋白水平結果以相對灰度值表示，即目的基因與內參（β-actin）灰度測量比值（n＝6）。

圖1 慢性應激對大鼠糖水偏好、曠野水平與垂直得分、強迫游泳漂浮不動時間的影響（n＝6）。與對照組比較，經方差分析，**P＜ 0.01，***P ＜ 0.001。Sucrose preference：糖水偏好；Number of squares crosted：曠野試驗水平得分；Number of groming and rearing：曠野試驗垂直得分；Immobolity time：漂浮不動時間

1.5 統計方法 采用SPSS 11.5處理數據，數據均以±s表示。所有指標進行one-way-ANOVA分析，組間比較用Bonferroni法。

2 結果

2.1 行為學評估 應激前，各組大鼠體重、糖水偏好、曠野試驗水平與垂直得分、強迫游泳漂浮不動時間無明顯差異 （P＞0.05）。應激 14 d時，CUMS14d組、CUMS 28d組和對照組的體重增長幅度、糖水偏好、曠野試驗水平與垂直得分及大鼠漂浮不動時間的差異均有統計學意義 （F值分別為 5.22、24.60、6.08、23.45、48.78，P 均小于 0.05），其中兩個模型組大鼠的前面4個指標均較對照組降低（P ＜ 0.05），而漂浮不動時間增加（P ＜ 0.05）。應激28 d時，與對照組相比，CUMS 28 d組大鼠的體重增長幅度、糖水偏好、曠野試驗水平與垂直得分也明顯降低（F值分別為4.39、42.86、32.16、22.18，P 均小于 0.05），大鼠漂浮不動時間增加，差異有統計學意義（F＝185.84，P ＜ 0.05）。見圖 1。

2.2 慢性應激對海馬神經干細胞增殖、存活和分化的影響 圖2顯示CUMS對海馬神經干細胞增殖的影響，BrdU陽性細胞主要位于亞顆粒細胞層（SGZ），呈簇狀，形狀不一，提示正在進行有絲分裂的不成熟細胞［5］。CUMS14d 組、CUMS28d 組與對照組海馬BrdU陽性細胞分別為（2254.17±164.41）、（1900.33±104.10）、（2919.50±188.80），3 組的差異有統計學意義 （F＝65.50，P ＜ 0.001）；前兩組均較對照組明顯減少（P＜0.001）。

圖3顯示CUMS對海馬神經干細胞存活的影響，BrdU陽性細胞形狀較為規(guī)整，呈圓形或橢圓形，BrdU沾染均一，單個分布在齒狀回區(qū)域。與對照組相比，CUMS 28 d組BrdU陽性細胞明顯減少，差異有統計學意義［（2404.50±148.77） vs（1845.33±126.88），F＝49.83，P ＜ 0.001）。

免疫熒光雙標顯示，與對照組相比，CUMS 28 d組 NeuN/BrdU 比例無明顯差異［（71.63±10.21） vs（69.11±11.30） P ＞ 0.05］；與對照組相比，CUMS 28 d組 GFAP/BrdU 比例無明顯差異［14.34±2.03）） vs（17.27±2.93），F＝2.61，P ＞ 0.05］。見圖 4。

2.3 慢性應激對Notch1信號系統各因子基因表達和蛋白水平的影響 CUMS14d組、CUMS28d組和對照組3組的Notch1信號通路各因子NICDmRNA、Hes1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1mRNA 的差異有統計學意義 （F 值分別為 151.57、165.13、21.26、156.01，P 均小于 0.01），前兩組均較對照組明顯減少（P ＜ 0.01）。見表1。

如表2所示，CUMS14d組、CUMS28d組和對照組 3組的 Notch1信號通路各因子 NICD、Hes1、Hes5、Jagged1的蛋白水平差異有統計學意義（F值分別為 96.59、28.65、5.99、67.56，P 均小于 0.01），前兩組均較對照組明顯減少（P＜0.01）。

圖2 慢性應激對海馬齒狀回神經干細胞增殖的影響（n＝6）。A、B、C分別顯示對照組、CUMS 14 d組和CUMS 28 d組海馬BrdU陽性細胞（10×），右下角所示為圖中箭頭所指的呈簇狀的BrdU陽性細胞在高倍鏡下的圖片（40 × ）。SGZ：亞顆粒層，GCL：顆粒層，Hilus：門區(qū)，下圖同。

圖3 慢性應激對海馬齒狀回神經干細胞存活的影響（n＝6）。A、B分別顯示經過28 d應激后對照組、CUMS 28 d組海馬的存活神經干細胞（10×）。

圖4 海馬齒狀回神經干細胞的分化（BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標）（20× ）（n＝6）

表1 慢性應激后各組大鼠Notch1信號通路各因子基因表達與對照組的比較

表2 慢性應激后各組大鼠Notch1信號通路各因子蛋白水平與對照組的比較

3 討論

本研究以CUMS方法建立抑郁癥模型，可比較真實、客觀的在大鼠身上模擬人類的抑郁癥狀［6］。本研究結果顯示，持續(xù)14天和28天的慢性溫和不可預知的應激和孤養(yǎng)法均可以抑制大鼠體重的增長幅度，大鼠糖水偏好度顯著降低，大鼠的總走格次數和直立活動均降低，強迫游泳漂浮不動時間均顯著增加，反映出應激后大鼠的快感缺乏，活動度和對新異環(huán)境探究度降低，符合動物抑郁癥狀的行動遲緩、被動和懶散，及應激導致的行為絕望，表明本研究成功建立了抑郁模型。本研究設定干預14 d和28 d兩個CUMS模型組，意在動態(tài)觀察應激對海馬神經干細胞再生和Notch信號的影響。

本研究結果顯示，形態(tài)學觀察顯示14 d和28 d抑郁模型組大鼠的海馬神經干細胞增殖減少，且海馬神經干細胞存活也較對照組明顯減少，表明抑郁大鼠的神經干細胞增殖和存活受到抑制；對照組與 CUMS組 NeuN/BrdU、GFAP/BrdU 無明顯差異，說明應激對神經干細胞分化為神經元或神經膠質細胞無明顯影響。這與目前大部分研究結果一致［7］。既往研究結果顯示，抑郁狀態(tài)下大鼠海馬神經干細胞增殖減少［8］；CUMS造摸能夠較好地模擬抑郁癥狀，并影響海馬齒狀回神經發(fā)生包括增殖、分化和存活［9］。本研究對海馬干細胞分化的結果進一步分析，發(fā)現BrdU陽性細胞中約70%為NeuN/BrdU陽性細胞，15%為 GFAP/BrdU陽性細胞，15%的BrdU陽性細胞未雙標。可能是干細胞分化的另一亞型細胞，或是位于組織深部，抗體達不到，或是尚未分化的細胞［9］。綜上所述，慢性應激干預的大鼠海馬齒狀回神經干細胞增殖和存活受到抑制，而對分化無明顯影響，進一步在動物模型中驗證了抑郁癥神經重塑障礙假說，表明神經再生在抑郁癥的發(fā)生中扮演重要角色。

Notch通路由 Notch受體、Notch配體 Jag1及DNA結合蛋白-CSL組成。Hes 1、Hes 5為Notch通路激活后的靶基因，NICD是Notch信號系統的胞內活性部分，我們選取NICD、Hes1、Hes5和Jag1作為檢測指標，可以較為全面的反映Notch通路的功能狀態(tài)。結果顯示，Notch1mRNA、Hes1mRNA、Hes5mRNA表達在慢性應激14 d和28 d后均顯著減少；Notch1、Hes1、Hes5蛋白水平在慢性應激 14 d和28 d后亦顯著減少。Notch通路基因和蛋白水平的下降，提示應激導致Notch信號系統功能的下調，且與慢性應激降低大鼠神經發(fā)生并行存在。既往研究表明，Notch信號通路在成年期維持神經干細胞的未分化狀態(tài)和自我更新中起到重要作用［10］。其中發(fā)揮關鍵性作用的bHLH基因有抑制型和促進型兩類，前者包括HES-1、HES-3和HES-5，后者包括神經分化發(fā)育相關基因Mash-1、Math、原神經基因Ngn。當抑制型bHLH基因表達時，神經干細胞的分化被抑制。通過上調HES-1和HES-5基因的表達，抑制神經干細胞分化成為神經元和膠質細胞，從而保持神經元和神經膠質細胞合適的數目和比例。當促進型bHLH基因表達上調時，不僅可以促使神經元的生成，而且可以誘導Notch配體的表達，這些配體可以活化鄰近細胞的Notch信號通路，上調其HES-1、HES-3和 HES-5的表達。從而保持其在未分化狀態(tài)，從而維持神經干細胞的穩(wěn)定和增殖［11］。因此，應激干預下Notch信號通路的動態(tài)變化，提示Notch1信號通路有可能與慢性應激狀態(tài)下海馬神經干細胞增殖和存活的調節(jié)有關。

本研究結果還顯示，Notch配體（Jag1）的mRNA表達和Jag1蛋白水平在慢性應激14 d和28 d后均顯著下降。研究表明，Jag1可通過作用于Notch受體和其下游效應器信號分子Shh等來促進神經干細胞的生存［12］。Jagl可誘導Shh蛋白的長期表達，海馬齒狀回的Shh過分表達增加海馬亞顆粒區(qū)細胞的增殖和神經發(fā)生［13］。在體外，Shh還可以增加室下區(qū)細胞的增殖。因此，本研究中Jag1表達的降低與Notch信號功能下調是一致的，這與其減少神經干細胞增殖和存活的作用有關。

我們前期在體實驗發(fā)現氟西汀促進正常大鼠海馬神經干細胞再生的同時Notch信號功能上調［3］，離體實驗發(fā)現Notch信號系統可能參與氟西汀上調胎鼠海馬神經干細胞增殖［14］。盡管如此，目前的研究結果尚不足以證實Notch信號通路參與抑郁大鼠海馬神經重塑的調節(jié)，理想的實驗是采用拮抗Notch信號的激活，觀察有無神經再生和抑郁行為的好轉。但由于γ泌肽酶抑制劑DAPT（Notch通路的常用阻斷劑）有明顯的腸道毒性，且參與體內多個信號系統的調節(jié)，DAPT的應用將造成包括癡呆樣的副反應，嚴重干擾實驗的觀察［14］。因而，在體實驗很難進一步驗證Notch信號通路在抑郁神經重塑中的作用。

綜上所述，本研究結果顯示，慢性應激狀態(tài)下Notch1信號通路下調的同時，海馬神經干細胞的增殖、存活受到抑制。二者發(fā)生的一致性，同時結合近年來有關Notch信號通路在成年后神經再生作用的研究結果，初步提示Notch1信號系統可能與抑郁狀態(tài)下海馬神經重塑障礙有關。下一步本研究擬以抗抑郁劑干預抑郁模型大鼠并同時觀察Notch1信號系統的改變以驗證本研究假說［15］，以期為探討抑郁障礙的發(fā)病機制有所貢獻。

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