應(yīng)用免疫抑制劑及中藥康脈膠囊抑制家兔血管支架植入后早期再狹窄的實驗研究

姚家琪，孫秋，李曉陵，尹志偉，劉松江，高杰，李令根

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

血管內(nèi)支架的臨床應(yīng)用經(jīng)歷了20多年的不斷更新和發(fā)展，我們經(jīng)歷了金屬支架、聚合物支架、涂層支架(包括藥物涂層支架)、放射性支架、生物可降解支架、載基因血管支架等等。隨著支架材質(zhì)的改良、制造工藝的完善、臨床技術(shù)的提高，支架的生物相容性、機械力學(xué)性能、抗腐蝕性和血液相容性也得到了明顯的提高，取得了令人可喜的成績。但是由于以上血管內(nèi)支架仍存在這樣或那樣的缺陷，血管內(nèi)支架再狹窄(in－stent restenosis，ISR)問題一直存在并沒有解決。血管內(nèi)支架如若植入人體或生物體，那么血管內(nèi)支架對人體以及生物體來說便是異物，而抗原的免疫原性的本質(zhì)是異物性。在免疫功能正常的條件下，具有異物或同種異物原性的物質(zhì)皆能誘導(dǎo)宿主的正免疫應(yīng)答?；谝陨峡紤]，我們提出了免疫抑制劑環(huán)孢素注射液及中藥康脈膠囊對防治ISR的可能性這樣一個研究課題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

20只體質(zhì)量2.4～2.6kg的健康新西蘭大白兔，均為雄性。實驗用試劑盒選用SP－9001/9002 Histostain TM－Plus Kits免疫組化染色試劑盒;抗體選用Mouse－Anti－PCNA增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA);Rabbit－Anti－VEGF 血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth fator，VEGF);Rabbit－Anti－CDK2細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(Cyclin－dependent kinase 2，CDK2);Rabbit－Anti－P21細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(p21Cip1)。實驗用血管內(nèi)支架選用德國amg醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司的冠狀動脈植入裸金屬支架(球囊膨脹展開式)，血管內(nèi)支架直徑:3.0mm血管內(nèi)支架長度:10mm～18mm。實驗用藥物選用瑞士諾華制藥有限公司生產(chǎn)的免疫抑制劑環(huán)孢素注射液，商品名:山地明注射液 ;規(guī)格:5mL:250mg×10支?？得}膠囊由哈爾濱大中藥業(yè)制藥廠提供。

1.2 實驗方法

新西蘭大白兔20只，雄性，體質(zhì)量2.4～2.6kg血管內(nèi)支架植入前正常飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后進(jìn)行血管內(nèi)支架植入術(shù)。16只成功植入髂動脈血管支架的家兔被隨機分成4組。1)裸支架組;2)環(huán)孢素組;3)康脈膠囊組;4)環(huán)孢素+康脈膠囊組。用20%烏拉坦5mL/kg經(jīng)家兔耳緣靜脈麻醉，用1%利多卡因4～5mL髂動脈區(qū)局部麻醉。制備家兔髂動脈血管支架內(nèi)再狹窄模型。

1.2.1 實驗用藥物用量及配制方法 免疫抑制劑:環(huán)孢素注射液的配制:250mg/5mL使用前先用生理鹽水稀釋成250mg/25mL，配好的制劑保存于4℃冰箱，使用前先復(fù)溫至室溫，搖勻后以備注射用。中藥康脈膠囊:根據(jù)前期家兔動物實驗研究康脈膠囊用量為0.56粒/kg，用生理鹽水稀釋成10mL/kg，以備灌胃。

1.2.2 各組用藥劑量及時間分配 用藥組給藥劑量:按照體表面積計算［1］。裸支架組:正常飼養(yǎng)直到處死;環(huán)孢素組:血管內(nèi)支架植入后，第1～5天(沖擊量)，按7倍于人環(huán)孢素注射液用藥劑量(人環(huán)孢素注射液用藥按7.5mg/kg/d劑量計算)，則家兔環(huán)孢素肌肉注射液用藥量為7.14mg/kg/d。第6～14天，按相當(dāng)于人環(huán)孢素注射液用藥7.5mg/kg/d劑量計算，則家兔肌肉注射環(huán)孢素注射液用藥量劑量為1.02mg/kg/d。第15～28天，按相當(dāng)于人環(huán)孢素注射液用藥5mg/kg/d劑量計算，則家兔肌肉注射環(huán)孢素注射液用藥量劑量為0.678mg/kg/d?？得}膠囊組:血管內(nèi)支架植入后，每日早晨進(jìn)食前30～60min用胃管按168mg/kg灌入康脈膠囊稀釋液，每日1次連續(xù)用藥、正常飼養(yǎng)至取材日。環(huán)孢素+康脈膠囊組:血管內(nèi)支架植入后，家兔環(huán)孢素注射液肌肉注射用量、方式及時間同環(huán)孢素組。每日康脈膠囊稀釋液灌胃用量、時間同康脈膠囊組。

1.2.3 造影及取材 術(shù)后4周各組含血管支架家兔髂動脈造影。麻醉處死家兔，無菌取出含血管支架的家兔髂動脈血管(包含上下相鄰5mm血管段)，一分為二。一部分用4%的多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋以備HE染色、免疫組化染色;另一部分用前固定液3%戊二醛固定以備掃描電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件包完成數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個均數(shù)的比較用單因素方差分析(one Way ANOVA)。方差齊性檢驗時，均數(shù)的多重比較用LSD檢驗。方差不齊時，均數(shù)的多重比較用基于t檢驗的保守的多重比較(Tamhane＇sT2)。

2 實驗結(jié)果

2.1 血管內(nèi)支架植入后各實驗組家兔髂動脈狹窄血管造影定量分析

分別測量各實驗組家兔血管內(nèi)支架植入前基礎(chǔ)血管直徑、家兔血管內(nèi)支架植入后即刻血管直徑、家兔血管內(nèi)支架植入后即刻血管直徑與基礎(chǔ)血管直徑比、28天后家兔血管直徑狹窄百分比見表1。各對比組家兔28天血管造影定量分析利用多個均數(shù)的比較單因素方差分析(one Way ANOVA)P值結(jié)果(見表2)。以上結(jié)果顯示，各組家兔右髂動脈血管直徑均有不同程度狹窄，但是以裸支架組和康脈膠囊組血管腔直徑狹窄明顯，而環(huán)孢素組和環(huán)孢素+康脈膠囊組血管腔直徑狹窄較輕。

表1 各組家兔髂動脈28天血管造影定量分析(±s)

表1 各組家兔髂動脈28天血管造影定量分析(±s)

2.44 ±0.02 2.49 ±0.15 2.48 ±0.03 2.49 ±0.02血管內(nèi)支架植入后即刻管徑(mm) 2.86 ±0.02 2.90 ±0.01 2.88 ±0.02 2.88 ±0.01血管內(nèi)支架植入后即刻管徑/基礎(chǔ)管徑 1.17 ±0.01 1.16 ±0.01 1.16 ±0.01 1.16 ±0.01 28 天后血管直徑(mm) 1.21 ±0.05 2.17 ±0.03 1.25 ±0.04 2.21 ±0.03 28 天后血管管徑丟失(mm) 1.23 ±0.03 0.27 ±0.02 1.23 ±0.04 0.25 ±0.08 28天后血管直徑狹窄百分比(%)康脈膠囊組基礎(chǔ)血管直徑(mm)裸支架組 環(huán)孢素A組 康脈膠囊組 環(huán)孢素A+50.4 ±1.70 10.9 ±0.70 49.7 ±1.70 10.0 ±3.11

表2 各對比組間家兔28天后血管造影P值比較

2.2 血管內(nèi)支架植入后各實驗組家兔髂動脈28天后掃描電鏡比較

掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)分別用1 000和2 000倍率拍片記錄。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢素注射液和環(huán)孢素注射液+康脈膠囊實驗組，血管內(nèi)支架的內(nèi)皮細(xì)胞更接近于正常內(nèi)皮細(xì)胞。提示應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢素注射液和環(huán)孢素注射液+康脈膠囊可以干預(yù)和預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞由于血管內(nèi)支架植入后引起的免疫排斥反應(yīng)。從血管內(nèi)皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)分布形態(tài)觀察，環(huán)孢素+康脈膠囊組新生血管內(nèi)膜表面血管內(nèi)皮細(xì)胞更接近正常細(xì)胞，說明中藥康脈膠囊與免疫抑制劑環(huán)孢素聯(lián)合應(yīng)用具有積極協(xié)同作用。

2.3 各實驗組家兔植入血管內(nèi)支架髂動脈組織切片對 PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1 蛋白表達(dá)影響

28天后各組實驗家兔植入血管內(nèi)支架髂動脈組織切片對PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響結(jié)果見表3。各對比組家兔多個均數(shù)的比較單因素方差分析(one Way ANOVA)P值結(jié)果(見表4)。在本實驗研究中發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素組和環(huán)孢素+康脈膠囊組具有抑制 PCNA蛋白表達(dá)、抑制 CDK2蛋白表達(dá)、抑制VEGF蛋白表達(dá)、增加VSMC的p21Cip1蛋白表達(dá)的趨勢。

表3 各實驗組家兔植入血管內(nèi)支架髂動脈組織切片對PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響(±s)

表3 各實驗組家兔植入血管內(nèi)支架髂動脈組織切片對PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響(±s)

組別PCNA VEGF CDK2 p21Cip1裸支架組 4 0.0906 ±0.0066 0.0432 ±0.0179 0.0690 ±0.0019 n 0.0198 ±0.0034環(huán)孢素 A 組 4 0.0319 ±0.0066 0.0100 ±0.0024 0.0318 ±0.0068 0.0868 ±0.0075康脈膠囊組 4 0.1020 ±0.0210 0.0340 ±0.0099 0.0609 ±0.0074 0.0343 ±0.0124環(huán)孢素 A+康脈膠囊組 4 0.0306 ±0.1985 0.0100 ±0.0017 0.0305 ±0.00730.0818 ±0.0054

表4 各對比組間家兔植入血管內(nèi)支架髂動脈組織切片對PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)P值比較

3 討論

血管內(nèi)支架植入術(shù)后再狹窄的機制十分復(fù)雜，是一個多因素共同作用的過程，目前為止研究者們提出了不少學(xué)說，包括早期的血管彈性回縮、血小板聚集和附壁血栓形成、損傷血管局部炎癥細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞)浸潤、新生內(nèi)膜增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管壁的重塑等，但真正確切的因果關(guān)系還需進(jìn)一步研究。有研究稱，冠狀動脈植入金屬裸支架后口服雷帕霉素組與對照組血管造影比較再狹窄率下降，管腔直徑縮小程度減輕。由此可見，雖然免疫抑制劑預(yù)防ISR的機制還不十分明了，但可以認(rèn)為免疫抑制劑的應(yīng)用在預(yù)防血管內(nèi)支架再狹窄是有效的。本實驗從家兔血管內(nèi)支架植入家兔髂動脈狹窄血管造影定量分析、血管內(nèi)支架植入家兔髂動脈28天后掃描電鏡比較、家兔血管內(nèi)支架髂動脈組織切片對PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1 蛋白表達(dá)影響等方面研究證明，免疫抑制劑環(huán)孢素及中藥康脈膠囊在預(yù)防家兔髂動脈血管內(nèi)支架早期再狹窄方面的有效性，由于本研究是小樣本研究，更明確的結(jié)論還需要大量的實驗研究觀察和更多實驗數(shù)據(jù)的支持，免疫抑制劑環(huán)孢素及中藥康脈膠囊在預(yù)防血管內(nèi)支架早期再狹窄方面的有效性有待于更進(jìn)一步的研究。

［1］ 陸東風(fēng)，劉威，李昭驥.雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖及DNA合成的影響［J］.嶺南心血管雜志，2002，8(6):418－420