流式細(xì)胞術(shù)檢測急性冠脈綜合征患者血小板表面糖蛋白的變化

張文超 韋建瑞 田穎

隨著人群的老齡化，動(dòng)脈粥樣硬化所帶來的血栓栓塞性疾病越來越受到重視，特別心腦血管疾病，其致殘率和致死率高，近年來阿司匹林的使用可以使心腦血管疾病高?；颊呓档?5%的心腦血管病事件如死亡，心肌梗死，卒中;降低48%的血管搭橋及動(dòng)脈栓塞事件;減少肺栓塞事件67%[1]。但是有大規(guī)模的臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究[2-4]均發(fā)現(xiàn)有阿司匹林抵抗現(xiàn)象。臨床長期隨訪時(shí)上發(fā)現(xiàn)應(yīng)用在使用抗血小板藥物后，仍然有一部分心腦血管疾病患者血栓栓塞事件，加大治療劑量，不僅未能達(dá)到治療及預(yù)防目的，而且不良反應(yīng)增加，這種現(xiàn)象稱為“阿司匹林抵抗”(Aspirin resistance AR)。所以對于危險(xiǎn)程度高的冠心病患者需要強(qiáng)化抗血小板治療，即聯(lián)合多種抗血小板藥物治療，這種強(qiáng)化治療很需要一種非常敏感而且可靠的血小板功能的檢測方法作為參考。但是目前尚沒有一個(gè)公認(rèn)的血小板功能檢測方法，大多都是反映血小板聚集的實(shí)驗(yàn)，而流式細(xì)胞術(shù)是通過檢測血小板活化時(shí)血小板表面的糖蛋白的表達(dá)，從免疫、受體水平評估血小板功能。本研究就是利用流式細(xì)胞儀(FCM)測定不同危險(xiǎn)程度的急性冠脈綜合征(ACS)患者的血小板表面糖蛋白的表達(dá)水平對其進(jìn)行分析及意義及FCM的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院自2010年4月至2010年9月連續(xù)入院的38例符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的初治的ACS患者(非ST抬高25例，不穩(wěn)定性心絞痛13例)，男21例，女17例，平均年齡為71.6歲。所有患者均經(jīng)心肌酶、心肌損傷標(biāo)志物，心電圖，急診或擇期冠脈造影證實(shí)。入院后每天于晨起餐后服用阿斯匹林100 mg，連續(xù)服用7～10 d，其他抗心肌缺血藥物均按指南使用，治療期間禁止使用其他明確的抗血小板藥物，如：波立維，抵克利得，GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：明確ST段抬高型心肌梗死，合并有各種血液系統(tǒng)疾病，具體如下：血友病、白血病、再障、ITP等特別是有血小板功能異常者;近期有外傷、手術(shù)及出血史;合并有肝腎疾病、腫瘤、脾亢、腦出血者;血小板計(jì)數(shù)在100～450萬之外者。健康對照組(Control)22例為同期我院無明顯心腦血管疾病的門診體檢者，男12例，女10例，平均年齡68.5歲。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 FACSCalibar流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，F(xiàn)alcon上樣管。

1.2.2 主要試劑 ①單克隆抗體：PAC-1 FITC為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗GPⅡb/Ⅲa(即纖維蛋白原受體，F(xiàn)ib-R)McAb，CD62P PE為藻紅蛋白標(biāo)記的抗P2選擇素的McAb;CD61 PerCP為Peridininchlorophyll protein標(biāo)記的血小板糖蛋白Ⅲa的McAb(均購自美國BD公司)。②同型對照：異硫氰酸熒光素標(biāo)記Mouse IgM、Mouse-PE為藻紅蛋白標(biāo)記的鼠IgG(均購自美國BD公司)。

1.2.3 樣本采集 病例組入院后服用阿司匹林前以及經(jīng)治療7～10 d病情穩(wěn)定后分兩次于晨起7時(shí)抽取肘前靜脈血，不扎止血帶，棄去前2 ml可能混有組織液的血液，將樣本加入CTAD管中，輕輕混勻，避免劇烈的搖動(dòng)而影響對血小板的檢測。20 min內(nèi)對血小板進(jìn)行熒光標(biāo)記、固定、檢測。

1.2.4 標(biāo)本制備 將試管標(biāo)號區(qū)分對照管和實(shí)驗(yàn)管。對照管內(nèi)加入 RGDS、Mouseγ-PE、CD61 PerCP 各 10 μl;試驗(yàn)管加入 PAC-1 FITC、CD62P PE、CD61 PerCP 各10 μl，輕輕混勻，避光室溫孵育20 min，立刻加入預(yù)冷2～8℃的1%多聚甲醛0.5 ml并混勻，放置于2～8℃冰箱中30 min。以上步驟均在2 h內(nèi)完成，以減少血小板體外活化。標(biāo)本制備后進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.2.5 上機(jī)檢測 用CellQuest軟件獲取并分析樣本，具體如下：a、FSC和SSC設(shè)對數(shù)放大閾值設(shè)在CD61PerCP上，b、在SSC和CD61PerCP點(diǎn)圖上圈定所有的血小板群，包括與白細(xì)胞粘附的血小板。c、用同型對照抗體染色的標(biāo)本調(diào)整FL1和FL2電壓如：CD61PerCP/同型對照 FITC/同型對照 PE，d、活化血小板染色的標(biāo)本調(diào)節(jié)補(bǔ)償，CD61PerCP/PAC-1 FITC/同型對照PE調(diào)節(jié)FITC對PE的干擾。e、CD61PerCP/同型對照FITC/CD62PPE調(diào)節(jié)PE對FITC的干擾。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，治療前后血小板糖蛋白之間的比較采用自身配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

38位入選的病例均圓滿完成實(shí)驗(yàn)，住院期間無心源性死亡及其他心源性事件發(fā)生、無嚴(yán)重的出血事件。ACS組的PAC-1及CD62P表達(dá)均高于Control組(P＜0.001)。經(jīng)以阿司匹林抗血小板治療為主的綜合治療后的血小板表面糖蛋白水平明顯較治療前下降，但仍高于正常對照組(P＜0.001)，見表1。

表1 各組治療前后血小板表面CD62P、Pac-1的表達(dá)率(%)

3 討論

近年來，隨著我國人口老齡化程度日益加劇及人民生活水平的提高，血栓性疾病的發(fā)生率不斷上升，血栓栓塞性疾病達(dá)到前所未有的重視，常表現(xiàn)為心肌梗死、缺血性腦卒中、外周血管栓塞性疾病。其中心血管疾病已成為當(dāng)今世界上威脅人類最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率已超過腫瘤性疾病而躍居世界第一[5]。

在血小板活化早期，血小板空間構(gòu)型發(fā)生改變，血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物構(gòu)型改變，其纖維蛋白原受體暴露，促進(jìn)纖維蛋白原與 GPⅡb/Ⅲa的相互識別和結(jié)合[6]。Pac-1為GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物纖維蛋白原受體，在血小板活化后，GPⅡb/Ⅲa受體的活性表達(dá)是引起血小板聚集的最后通路，檢測血小板表面Pac-1的表達(dá)量可以更精確地在更早階段檢測到血小板的活化。

P-選擇素(P-selection，gmp-140)又名血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白或CD62P，位于血小板內(nèi)的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞棒管狀小體內(nèi)。血小板活化時(shí)，血小板α顆粒膜與質(zhì)膜融合，CD62P暴露于血小板質(zhì)膜表面，成為血小板活化的一個(gè)特征性指標(biāo)[7]。CD62P通過血小板P2選擇素介導(dǎo)血小板黏附于內(nèi)皮細(xì)胞及血小板與中性粒細(xì)胞、血小板與單核細(xì)胞連接，從而產(chǎn)生中性粒細(xì)胞激活，血管活性物質(zhì)、氧代謝產(chǎn)物釋放，纖維蛋白原沉積等多種生物學(xué)效應(yīng)，啟動(dòng)血栓形成過程。CD62P與血漿黏度、纖維蛋白原濃度呈正相關(guān)[8]，因此，CD62P的升高可作為血栓疾病的病情監(jiān)測和評價(jià)血栓前狀態(tài)的有效指標(biāo)。

本研究ACS組治療前CD62P/PAC-1兩者都明顯高于對照組(P＜0.000)，且治療后其表達(dá)明顯下降但仍和對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證實(shí)在ACS患者的發(fā)病過程中，血小板CD62P/PAC-1表達(dá)可能血小板活化有關(guān)，在Marcus E[9]等體外研究中發(fā)現(xiàn)在活化的血小板表面存在 CD62P、PAC-1、CD63、CD107a表達(dá)，低劑量的阿司匹林可以降低CD62P和CD107a表達(dá)，高劑量的阿司匹林可以抑制PAC-1、CD63表達(dá)。經(jīng)過以阿司匹林為主的綜合治療后，兩者表達(dá)下降明顯，提示阿司匹林能夠顯著抑制血小板表面糖蛋白的表達(dá)，這與國內(nèi)外的類似研究結(jié)論相仿。ACS患者經(jīng)治療穩(wěn)定后仍有大概4～5%的血小板仍處于活化狀態(tài)，考慮可能與基礎(chǔ)疾病、治療觀察時(shí)間及阿司匹林抵抗有一定關(guān)系。此外本研究還提示ACS患者的PAC-1表達(dá)明顯高于對照組，即使是治療后也還高于對照組，表明PAC-1是血小板急性激活的指標(biāo)，在急性冠脈綜合征患者GPⅡb/Ⅲa受體的活性表達(dá)是引起血小板聚集的最后通路，新型GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑可以有效抑制血小板聚集，目前國內(nèi)外[10]隨機(jī)對照的臨床試驗(yàn)證實(shí)，在PCI手術(shù)后GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑可以有效地抑制血小板聚集，減少亞急性血栓形成。本研究結(jié)論也提示非ST段抬高型心肌梗死組的PAC-1表達(dá)明顯高于不穩(wěn)定性心絞痛組，也從免疫學(xué)角度為GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑在ACS的使用提供了較為有利的依據(jù)?？偤鸵陨衔墨I(xiàn)和本研究認(rèn)為流式細(xì)胞術(shù)可以用來檢測血小板活化功能的，在目前尚無國內(nèi)外認(rèn)可的血小板功能檢測方法，流式細(xì)胞術(shù)是不錯(cuò)的選擇。PAC-1是血小板GPⅡb/Ⅲa受體，其表達(dá)能夠更早的反應(yīng)血小板活化，而CD62P作為血小板激活的標(biāo)志，可以作為血栓性疾病的血小板功能的檢測指標(biāo)。本試驗(yàn)不足之處：沒有對阿司匹林進(jìn)行對照，不能說明血小板活化率的下降是否與之有關(guān)。

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