星點設計-效應面法優(yōu)化山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片處方

陳海亭， 尹蓉莉， 陳金玉， 王寶才， 黨萬太， 呂懿平

(成都中醫(yī)藥大學，四川成都611137)

山楂葉總黃酮(又稱益心酮)，是從山楂葉中提取的黃酮類化合物的總稱，對心血管疾病有明顯的確切療效［1-3］。目前已有山楂葉總黃酮的中成藥制劑(益心酮系列產(chǎn)品)上市，有益心酮糖衣片、分散片、口服液、軟膠囊、滴丸、注射液、泡騰片、凍干速溶片等［4］，但其有效成分溶解度小而影響吸收使大多數(shù)山楂葉總黃酮普通制劑生物利用度低［5］。本實驗采用增加溶解度調(diào)節(jié)劑的方法［6-8］，改善山楂葉總黃酮的溶解度，從而將其制成微孔滲透泵控釋片，提高其生物利用度，減少每天服用次數(shù)，而達到作用持久，增加患者順應性的目的。同時為難溶性中藥有效組分滲透泵控釋給藥系統(tǒng)的研究提供一定的參考依據(jù)。

星點設計(central composite designs，CCD)又稱中心組合設計，是一種多因素多水平優(yōu)化設計，可用三維效應面進行數(shù)據(jù)處理及非線性方程擬合，模擬方程可較好的預測結(jié)果［9］。國內(nèi)常采用正交和均勻設計，但兩者均基于線性模型，只能表明某一因素的取值方向而無法求得極值，所以預測的結(jié)果不夠精確［10］。本實驗采用星點設計結(jié)合效應面分析法優(yōu)化山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片的處方。

1 材料和儀器

蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100080-200707);山楂葉總黃酮提取物(規(guī)格:總黃酮質(zhì)量分數(shù)≥80%，UV法;購于西安天園生物制劑廠);二醋酸纖維素(國家集團化學試劑有限公司);乳糖(成都市科龍化工試劑廠);丙酮(成都市科龍化工試劑廠);異丙醇(成都市科龍化工試劑廠);鄰苯二甲酸二乙酯(DBP，成都市科龍化工試劑廠);PEG-400(成都市科龍化工試劑廠);PVP-K30(成都市科龍化工試劑廠);滑石粉(藥用)，其它試劑為分析純。

TDP-I型單沖壓片機 (上海中藥機械廠);BY-300A型小型包衣機(上海黃海藥檢儀器廠);UV-1100型紫外分光光度計;ZRS-8G智能溶試驗儀(天津天大天發(fā)科技有限公司);BP211D-型電子分析天平(德國Sartorius);BF-200S-WEI型電子天平(德國Sartorius);BUG25-12型超聲波清洗器(必能信超聲上海有限公司);DGG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2．1 山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片的制備 將山楂葉總黃酮與輔料分別過80目篩。取處方量的山楂葉總黃酮與輔料按等量遞增法混合均勻，然后加入5%的PVP乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，40℃烘箱中干燥2 h，然后2號篩整粒，加入適量的滑石粉混勻壓片，即得片芯。

適量的二醋酸纖維素加入丙酮-異丙醇(100∶3)的混合溶液中，在超聲條件下至完全溶解，然后加入適量的致孔劑PEG-400和增塑劑DBP。將片芯放入包衣鍋內(nèi)，噴霧速度保持在4．5 mL/min，包衣溫度40℃，包衣鍋轉(zhuǎn)速為30 r/min，至包衣膜增重達到要求即可。

2．2 標準曲線的繪制 精密稱取120℃減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對照品10．25 mg，置50 mL的量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，既得0．205 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取對照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(附錄V A)，于500 nm的波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度對吸光度進行線性回歸，得回歸方程 Y=0．012 1X －0．004 2(r=0．999 6)說明質(zhì)量濃度與吸光度之間線性關系良好，線性范圍為8．2 ～49．2 μg/mL。

2．3 釋放度測定方法 取本品，按照《中國藥典》(2010年版二部附錄XC)釋放度測定法第二法:槳法，以500 mL經(jīng)脫氣處理的蒸餾水為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出介質(zhì)的溫度為(37±0．5)℃。依法操作，在 2、4、6、8、10、12 h 分別取溶液 5 mL，0．45μm微孔濾膜過濾，并及時向溶出杯中補充介質(zhì)5 mL。取續(xù)濾液稀釋適當倍數(shù)后同2．2項顯色，以相應的試劑為空白，在500 nm的波長處測定吸光度，帶入標準曲線計算不同時間山楂葉總黃酮的累積釋放度。

2．4 星點試驗設計 預實驗表明乳糖用量、致孔劑PEG400用量、包衣增重率是影響山楂葉總黃酮滲透泵控釋片釋放的主要因素。因此選擇乳糖用量(X1)，致孔劑用量(X2)，包衣增重率(X3)為考察因素，以山楂葉總黃酮滲透泵控釋片在2、6、12 h的累積釋放度Y2、Y6、Y12為評價指標做三因素五水平的星點設計。根據(jù)星點設計原理，各因素取5個水平，用代碼－α、－1、0、+1、+α來表示。對于三因素星點設計α=1．732，在預實驗基礎上設定X1范圍:120～240 mg/片;X2范圍:60% ～120%;X3范圍:3%～6%。因素和水平代碼以及實驗安排結(jié)果見表1和表2。

表1 星點設計的因素和水平代碼Tab．1 Variables and codes of composite design

2．5 模型擬合 用 Design-expert7．1．6統(tǒng)計軟件，以各時間點累積釋放度為評價指標分別對各考察因素進行多元線性回歸和二項式方程擬合。

多元線性回歸方程:

表2 星點實驗安排及實驗結(jié)果Tab．2 Factor and response of control com posite design

二項式擬合方程:

從以上擬合方程的相關系數(shù)可知，多元線性回歸方程的相關系數(shù)明顯低于二項式擬合方程的相關系數(shù)?？梢姸嘣€性回歸擬合度不佳，預測性較差，因此選擇二項式模型為最佳擬合模型。

2．6 效應面優(yōu)化和預測 三維效應圖只能表達兩個因素和指標的函數(shù)關系，所以固定其中一個因素，設為中間值，對各評價指標做三維效應圖和等高線(觀察各組因素的三維效應圖和等高線可知X3對Y12的影響顯著。)由圖1和圖2可知，為滿足藥物釋放要求使Y12＞90%，X3取值為3．7，將其代人上述擬合較優(yōu)的二項式方程，采用Design-expert7．1．6軟件繪制X1、X2對各指標的三維效應圖和二維等高線圖。見圖3～5。

圖1 X1和X3對Y12影響的三維效應圖及等高線Fig．1 Response surface and contour p lot of Y12 as a function of X1 and X2

圖2 X2和X3對Y12影響的三維效應圖及等高線Fig．2 Response surface and contour plot of Y12 as a function of X2 and X3

圖3 Y2的三維效應圖及等高線圖Fig．3 Response surface and contour p lot of Y2

圖4 Y6的三維效應圖及等高線圖Fig．4 Response surface and contour p lot of Y5

圖5 Y12的三維效應圖及等高線圖Fig．5 Response surface and contour plot of Y12

根據(jù)滲透泵控釋制劑零級釋放的特性，設定山楂葉總黃酮滲透泵控釋片各時間點累積釋放度的區(qū)域，Y2范圍:20% ～30%;Y6范圍:60% ～70%;Y12范圍:＞90%。然后按此要求重疊各指標的二維等高線圖，得到能同時滿足以上條件的最佳區(qū)域。重疊等高線圖見圖6，圖中重疊的白色區(qū)域即為處方的最佳區(qū)域。

圖6 處方優(yōu)化的重疊等高線圖Fig．6 Over lay contour p lot of the optim ixed formu lation

由圖3～5可看出三維效應圖均為曲面，說明乳糖用量(X1)和致孔劑用量(X2)和各時間點的累積釋放度存在非線性關系。圖1表明隨著乳糖用量(X1)的增大，Y2逐漸減小;隨著孔劑用量(X2)的增大，Y2先逐漸減小，后逐漸增大;圖2說明隨著致孔劑用量(X2)的增大，Y4逐漸增大;圖3說明隨乳糖用量(X1)的增大，Y12先增加后減小;隨著致孔劑用量(X2)的增大，Y12逐漸增大。以上說明乳糖用量(X1)和致孔劑用量(X2)對不同時間的藥物釋放的影響不同。

2．7 優(yōu)化處方的驗證 在上述最佳區(qū)域內(nèi)選取3個點作為驗證處方進行壓片、包衣和釋放度測定。驗證處方評價指標實際值和預測值見表3，可知評價指標的實際值和預測值相對偏差絕對值均小于5%，說明實驗所得擬合方程可以很好的預測各因素和評價指標之間的關系。釋放曲線見圖7，可見3個驗證處方釋藥曲線的 R2值分別為0．982 6、0．980 1、0．984 2，說明零級釋放特性良好。

表3 優(yōu)化處方評價指標的預測值和實測值

圖7 驗證處方的釋藥曲線

3 討論

目前國內(nèi)在藥劑處方的優(yōu)化時多采用正交設計和均勻設計，且兩者都是是基于線性模型的設計［11］。通常各因素對效應的影響并非呈線性關，所以正交設計和均勻設計的精度不高，建立的數(shù)學模型的預測性差［10］。星點設計和效應面優(yōu)化法是近幾年來國外藥學工作者常用的實驗設計和優(yōu)化法，使用方便，優(yōu)選條件預測性好［12］，且可用于非線性模型的設計。因此本實驗采用星點設計結(jié)合效應面法，通過線性和非線性擬合得到最佳擬合方程，繪制三維效應面圖和等高線圖，采用重疊等高線圖法［13］，得到最佳處方范圍。

為了得到較好的優(yōu)化結(jié)果，在進行響應面優(yōu)化法之前，應保證設計的實驗點應包括最佳的實驗條件，如果實驗點的選取不當，使用響應面優(yōu)化法則不能得到很好的優(yōu)化結(jié)果的。所以在使用響應面優(yōu)化法之前，應當確立合理的實驗因素與水平［12］。所以本實驗首先采用單因素考察篩選出影響藥物的釋放主要因素及其水平范圍，以保證得到較佳的優(yōu)化結(jié)果。

最佳處方范圍的3個處方評價指標的實際值和預測值的相對偏差的絕對值較小，零級釋放特性明顯，說明實驗所得到的擬合方程可以較好地預測各因素與評價指標指標的關系。因此本實驗采用星點設計-效應面法優(yōu)化山楂葉總黃酮滲透泵控釋片處方，所得處方符合要求，說明本方法可行。

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