普伐他汀與華法林聯(lián)合應用對兔激素性股骨頭壞死的影響*

李挺松， 肖增明， 詹新立

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西南寧530021)

臨床上長期使用糖皮質激素的患者，如系統(tǒng)紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎移植等病人，激素性股骨頭壞死(steroid－induced osteonecrosis of femoral head，SIONF)發(fā)生率較高(22% － 44%)[1，2]，不少患者需行關節(jié)置換術，因此從可能的發(fā)病機理上予以干預顯得尤其重要。究其原因，多數(shù)學者認為綜合因素所致[3]，其中高脂血癥和高凝狀態(tài)所致股骨頭營養(yǎng)血管脂肪栓、血栓栓塞，從而引起股骨頭缺血壞死的說法更受關注[4，5]。動物實驗顯示他汀類降脂藥能減少SIONF發(fā)生率[6];單獨使用抗凝藥華法林有降低SIONF傾向，但無統(tǒng)計學上差異[5]。降脂抗凝聯(lián)合使用干預SIONF發(fā)生率情況如何，鮮有報道。本研究探討普伐他汀聯(lián)合華法林的降脂抗凝共同作用對兔SIONF的影響，旨在為臨床防治SIONF提供一途徑。

材料和方法

1 材料

健康成年雌性日本大白兔，年齡28－32周，體重2.8－3.4 kg，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。所有動物按標準動物飼料分籠喂養(yǎng)，自由飲水。甲基強的松龍(methylprednisolone，MPSL;Upjohn)，普伐他汀(中美上海施貴寶制藥有限公司提供)，華法林(Orion Corporation)。總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)測試盒(上海執(zhí)誠生物技術有限公司)，凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和活化部份凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)測 試 盒 (Instrumentation Lab.)。7170A血生化全自動分析儀和500 mA X線攝片機(HITACHI)，ACL TOP全自動凝血分析儀(Beckman Coulter)石蠟切片機和DMR－Q550病理圖文分析系統(tǒng)(Leica)，H－500透射電鏡(TOSHIBA)。

2 方法

2.1 SIONF動物模型建立 以左髖部股骨頭關節(jié)作實驗觀察。兔SIONF動物模型建立參照Yamamoto等[7]造模方法進行。檢疫觀察1周后，所有動物隨機分為3組，CTR組(對照組)12只，等量生理鹽水右臀部肌肉注射1次。SIONF組(實驗組)18只，甲基強的松龍20 mg/kg右臀部肌肉注射1次。PW組(干預組)18只，造模方法同SIONF組，口服普伐他汀 2.5 mg·kg－1·d－1及華法林 1.5 mg·kg－1·d－1，與飼料混合服用，密切觀察不能漏服。整個實驗間期0－12周。

2.2 血脂、凝血指標測定 各組動物分別于實驗前及實驗后第 2、4、6、8、10、12 周，早晨抽空腹靜脈血6 mL，取血前禁食12 h。測定血清 TC、TG及血漿PT、APTT。

2.3 X線攝片及骨組織形態(tài)學檢查 在實驗第4、6、8、10周，隨機抽取2只動物，第12周處理剩下動物。首先予氯胺酮2.5 mg/kg肌注麻醉后，行雙側髖關節(jié)X線攝片，然后耳緣靜脈空氣栓塞法處死兔子。雙側股骨頭標本取材，觀察大體病理。將左側股骨頭沿冠狀面切開，10%甲醛固定24 h，8%甲酸溶液中脫鈣48－72 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切開后行HE染色，病理圖像分析儀測量股骨頭軟骨下區(qū)平均骨陷窩空虛率作為評價骨組織壞死程度。

2.4 透射電鏡細胞超微結構觀察 將左股骨頭沿冠狀面切開，在股骨頭軟骨下1.5－3.0 mm處取2 mm×2 mm×2 mm大小骨塊，于2.5%戊二醛4℃環(huán)境下前固定，10%EDTA 4℃環(huán)境下脫鈣1周，1%鐵酸后固定，常規(guī)包埋，制成超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鋁雙染色，透視電子顯微鏡觀察。

2.5 判斷骨壞死組織學改變依據(jù) 骨小梁骨陷窩空虛程度，骨細胞核固縮，骨細胞碎片存在情況[8]。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

結 果

1 一般體征

實驗前后，CTR組動物無死亡，兔子精神、食欲正常，毛澤光亮，體重明顯增加，活動如常。SIONF組兔子精神萎糜，食欲不振，毛澤枯槁，消瘦，4周后有3只出現(xiàn)蹣跚步態(tài)，至第12周每只兔子出現(xiàn)不同程度跛行，行動受限，易于感染，于第5、7周因腹瀉、肺炎各死亡1只。PW組動物精神稍差，食欲有減，毛色稍灰暗，體型消瘦，但運動跳躍動作仍較好。于第4、8周因肺炎、皮膚感染各死亡1只。

2 實驗前后血脂及凝血變化

從實驗第6周開始持續(xù)到實驗終點，PW組TC水平較CTR組高(P＜0.05)，但較SIONF組低(P＜0.05)，而 SIONF組 TC顯著高于 CTR組(P＜0.01)。TG水平從實驗第8周開始，3組之間有類似血清TC變化，見表1、2。

從實驗第2周開始到實驗終點，PW組動物血漿PT較CTR組及SIONF組明顯延長(P＜0.01)，相反SIONF組PT較CTR組及PW組顯著縮短(P＜0.05)。APTT結果3組之間亦有類似PT變化，見表3、4。

表1 各組不同時點血清TC變化Table 1.Serum TC changes at different time points(mmol/L.±s)

表1 各組不同時點血清TC變化Table 1.Serum TC changes at different time points(mmol/L.±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs SIONF group.

Group n Pre－experiment 2nd week 4th week 6th week 8th week 10th week 12th week Control 12 1.75 ±0.20 1.72 ±0.21 1.730 ±0.23 1.70 ±0.18 1.72 ±0.17 1.69 ±0.24 1.70 ±0.27 SIONF 16 1.79 ±0.24 1.82 ±0.21 2.240 ±0.25* 3.10 ±0.19＊＊ 3.34 ±0.22＊＊ 3.55 ±0.18＊＊ 4.12 ±0.29＊＊PW treatment 16 1.81 ±0.23 1.80 ±0.19 1.84 ±0.22 2.02 ±0.21# 2.13 ±0.14# 2.21 ±0.16*#2.42 ±0.19*##

表2 各組不同時點血清TG變化Table 2.Serum TG changes at different time points(mmol/L.±s)

表2 各組不同時點血清TG變化Table 2.Serum TG changes at different time points(mmol/L.±s)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs SIONF group.

Group n Pre－experiment 2nd week 4th week 6th week 8th week 10th week 12th week Control 12 1.44 ±0.21 1.40 ±0.18 1.45 ±0.21 1.39 ±0.23 1.40 ±0.20 1.42 ±0.19 1.38 ±0.20 SIONF 16 1.42 ±0.20 1.44 ±0.19 1.63 ±0.21 1.70 ±0.18 2.14 ±0.20*2.40 ±0.22*3.10 ±0.23*PW treatment 16 1.41 ±0.23 1.42 ±0.24 1.52 ±0.19 1.58 ±0.22 1.62 ±0.24 1.74 ±0.18#2.10 ±0.23*#

表3 各組不同時點血漿PT變化Table 3.Plasma PT changes at different time points(s.±s)

表3 各組不同時點血漿PT變化Table 3.Plasma PT changes at different time points(s.±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs SIONF group.

Group n Pre－experiment 2nd week 4th week 6th week 8th week 10th week 12th week Control 12 14.11 ±2.13 14.78 ±3.01 14.50 ±2.01 13.91 ±1.90 14.01 ±2.10 15.01 ±2.30 14.22 ±2.10 SIONF 16 14.86 ±2.20 13.35 ±2.90 13.01 ±1.90 11.11 ±2.01 12.02 ±1.91 10.14 ±1.89* 9.98 ±1.83*PW treatment 16 13.96 ±2.23 22.13 ±1.94＊＊##24.51 ±2.81＊＊##28.34 ±2.91＊＊##29.12 ±2.82＊＊##31.98 ±3.08＊＊##30.01 ±31.40＊＊##

表4 各組不同時點的血漿APTT變化Table 4.Plasma APTT changes at different time points(s.±s)

表4 各組不同時點的血漿APTT變化Table 4.Plasma APTT changes at different time points(s.±s)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs SIONF group.

Group n Pre－experiment 2nd week 4th week 6th week 8th week 10th week 12th week Control 12 36.33 ±3.10 35.82 ±3.01 36.14 ±2.87 36.41 ±2.90 35.78 ±2.51 36.04 ±2.64 36.12 ±3.02 SIONF 16 35.30 ±3.41 33.16 ±3.05 30.21 ±2.50 29.24 ±2.40* 28.02 ±2.11* 27.19 ±2.61* 24.47 ±3.10*PW treatment 16 36.55 ±3.51 40.11 ±4.12 42.01 ±3.92*# 48.12 ±4.01*##48.56 ±3.96*##49.08 ±3.84*##49.10 ±3.15*##

3 股骨頭X線表現(xiàn)

CTR組股骨頭各時點抽樣檢查X線表現(xiàn)無異常。SIONF組從第6周開始股骨頭出現(xiàn)骨小梁模糊，不規(guī)則透亮區(qū)，到實驗終點絕大部分有不同程度軟骨面塌陷。PW組股骨頭可見骨質疏松，少部份軟骨面塌陷。

4 骨組織形態(tài)學檢查發(fā)現(xiàn)

CTR組各時點抽樣的股骨頭組織形態(tài)正常，見圖1。SIONF組實驗第6周開始髓內(nèi)脂肪細胞增大，軟骨下區(qū)骨陷窩空泡點狀分布。第12周髓基質大量脂肪化，髓腔內(nèi)血管受壓，管腔變窄，血栓形成，見圖2，骨細胞核固縮、溶解，成骨細胞幾乎消失，可見骨細胞碎片，骨陷窩空虛率明顯增加。PW組從8周到實驗終點髓內(nèi)基質脂肪轉化率低，少量骨陷窩空泡出現(xiàn)，骨小梁排列規(guī)則，無明顯的骨髓細胞碎片，髓內(nèi)血管走向基本正常，未見血栓形成，見圖3。

5 透射電鏡觀察

實驗終點時顯示，CTR組股骨頭骨細胞膜周圍伸出細小絨毛進入基質中，細胞核清晰，粒漿比例1∶1，胞漿內(nèi)細胞器完整，見圖4。SIONF組細胞膜突起消失，核膜不清，胞漿內(nèi)細胞器溶解，細胞核固縮，并有自溶現(xiàn)象，見圖5。PW組骨細胞突起尚存核膜較清晰，胞漿內(nèi)細胞器溶解及核固縮現(xiàn)象顯著較SIONF組減輕，見圖6。

6 3組SIONF發(fā)生率

以骨壞死的組織改變?yōu)橐罁?jù)判斷，3組SIONF發(fā)生率分別為:CTR組0%(0/12)，SIONF組63%(10/16)和PW組31%(5/16)，PW組較SIONF組顯著減少(P＜0.05)。

Figure 1.Normal bone tissues in control group 12 weeks after experiment(HE staining，×20).圖1 實驗12周后CTR組正常骨組織

Figure 2.12 weeks after experiment，bone tissues in SIONF group showed large numbers of adipose cells and intravascular thrombosis(→)(HE staining，×20).圖2 實驗12周后SIONF組骨組織可見大量脂肪細胞及血管內(nèi)血栓

Figure 3.12 weeks after experiment，bone tissues in PW treatment group showed less adipose cells and no significant intravascular thrombosis(HE staining，×20).圖3 實驗12周后PW組骨組織可見少量脂肪細胞，無明顯血管內(nèi)血栓

Figure 4.12 weeks after experiment，bone cells in control showed normal form of rough endoplasmic reticulum(→)(TEM，×7 700).圖4 實驗12周后CTR組骨細胞中正常粗面內(nèi)質網(wǎng)的形態(tài)

Figure 5.12 weeks after experiment，bone cells in SIONF group showed phagocytosis of fat droplets(→)and karyopyknosis(TEM，×7 700)圖5 實驗12周后SIONF組骨細胞吞噬脂肪小滴，細胞核固縮

Figure 6.12 weeks after experiment，bone cells in PW treatment group showed clear nuclear membrane(→)and significantly－reduced nuclear condensation(TEM，×7 700).圖6 實驗12周后PW組骨細胞核膜清晰，核固縮顯著減輕

討 論

激素誘導的股骨頭壞死SIONF是臨床長期應用糖皮質激素患者如系統(tǒng)紅斑狼瘡、器官移植后等的嚴重并發(fā)癥[1，9]。迄今為止 SIONF發(fā)病機制仍不明潦，多數(shù)學者認為與多因素有關，如高脂血癥、高凝狀態(tài)、髓內(nèi)營養(yǎng)血管內(nèi)皮受損、血管炎癥等[10，11]。正由于這原因，臨床或動物實驗對SIONF研究較有限且結論不一致[6，12]。本文以兔SIONF動物模型進行探討，采用高劑量(20mg/kg)甲基強的松龍單次肌肉注射造模方法[7]。激素肌肉注射后第6周開始骨組織發(fā)生形態(tài)上病態(tài)改變，與既往文獻報道發(fā)生于使用激素后 2－20周[4，10]，基本相符。采用軟骨下骨小梁陷窩空虛率或骨細胞核固縮、溶解程度為標準判斷骨壞死[8，13]。由于高脂高凝狀態(tài)為目前SIONF機制中研究熱點，本文以降脂抗凝聯(lián)合應用干預SIONF進行研究。普伐他汀為最常用的他汀類降脂藥，華法林為目前最有效的口服抗凝藥。普伐他汀聯(lián)合華法林應用對SIONF兔的股骨頭影響結果顯示，PW組SIONF發(fā)生率為31%(5/16)，而SIONF組為63%(11/16)(P＜0.05)，這結果與 Nishida等[8]報道結果較一致。

本研究通過檢測血清TC和TG來f反映實驗動物脂肪代謝狀態(tài)，其結果顯示，從實驗第6周開始到實驗終點，SIONF組TC、TG逐漸顯著高于CTR組及PW組，而PW組TC、TG雖然高于CTR組，但仍然低于SIONF組(P＜0.05)，這樣的血脂代謝情況使實驗動物體循環(huán)形成高脂、高黏狀態(tài)。由于激素誘導的骨缺血壞死主要發(fā)生于股骨頭而不在長骨或其它關節(jié)[7]，所以股骨頭骨髓內(nèi)將出現(xiàn)高脂代謝狀態(tài)，本研究結果支持這觀點。SIONF組實驗第6周開始股骨頭骨髓內(nèi)脂肪細胞增大，髓質大量脂肪化，而PW組髓內(nèi)脂肪化明顯減弱，CTR組髓內(nèi)組織形態(tài)正常，與最近Nishida等[8]研究結果較一致。本文沒有直接確定普伐他汀預防SIONF發(fā)生發(fā)展機制，但認為可能與通過降低體循環(huán)高脂、高黏狀態(tài)從而改善股骨頭骨髓內(nèi)異常血脂有關。他汀類藥為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑，競爭性抑制體內(nèi)膽固醇合成過程中限速酶(HMG－CoA還原酶)活性，從而阻斷膽固醇的生成，繼而上調(diào)細胞表面低密度脂蛋白(LDL)受體，加速血漿LDL的分解，從而降低TC、LDL及TG。他汀類藥為應用已久療效肯定，且目前仍最廣泛使用的降脂藥，臨床治療各種高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化心臟病等療效明確[14]。動物試驗及臨床觀察分析他汀類降脂藥可降低SIONF的發(fā)生率及發(fā)展[6]。但他汀類藥物干預SIONF發(fā)生、發(fā)展機制未明。大多數(shù)學者認為高脂血癥、凝血功能異常導致髓內(nèi)營養(yǎng)血管脂肪栓子、血栓子機械阻塞[8，11]，而他汀類藥可降低血脂、減少脂肪栓子形成，從而改善髓內(nèi)血供[6]。另有學者認為，他汀類藥對干預SIONF的有益作用可通過非降脂作用起效[15]，這種非降脂作用包括改善血管內(nèi)皮細胞功能、抗血栓作用、減少血管炎癥、抗氧化功能[16－18]。最近還有學者研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物通過抑制骨髓基質細胞表達脂肪細胞特異性轉錄分化因子PPARγ2，促進成骨細胞特異性分化與轉錄因子Cbfa1/Runx2表達，從而抑制脂肪分化，促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化[19]。他汀類藥物上述多種因素可能對預防SIONF的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與SIONF組比較，PW組從實驗第2周開始PT顯著延長(P＜0.01)，持續(xù)到實驗終點。相反，與CTR組比較，SIONF組從實驗第8周開始PT顯著縮短(P＜0.05)，持續(xù)至實驗終點，APTT結果亦類似變化，這與 Nagasawa等[5]報道結果較吻合。SIONF組股骨頭營養(yǎng)血管內(nèi)血栓形成、而PW組未見明顯血栓。華法林有直接全身抗凝作用，普伐他汀降脂藥也有抗血小板作用[15]，從而改善了SIONF動物全身凝血功能紊亂導致的高凝狀態(tài)，減少血栓栓塞、降低髓腔內(nèi)壓力，減輕股骨頭低氧血癥、缺血壞死。臨床上雖然華法林常用于治療靜脈系統(tǒng)的血栓防治，例如下肢靜脈血栓形成，肺動脈栓塞，而SIONF多發(fā)生于髓內(nèi)營養(yǎng)血管或微小動脈內(nèi)血栓，但華法林是通過改善SIONF動物循環(huán)高凝狀態(tài)從而減少骨髓內(nèi)血管血栓而獲益。Asada等[20]報道自身骨髓細胞移植干預兔SIONF獲益，其機制也是改善外周循環(huán)的凝血、纖溶系統(tǒng)而起作用。最近有報道，長期服糖皮質激素系統(tǒng)紅班狼瘡病人，同時口服華法林能有效減少SIONF發(fā)生，特別是無癥狀的 SIONF患者，但仍無顯著差異(P ＞0.05)[5]，其原因可能為SIONF是多種危險因素所致，包括血管內(nèi)高凝、血脂代謝紊亂、氧自由基作用及血管內(nèi)皮受損等[18，21]，它們之間相互關聯(lián)促進作用，這多因素對股骨頭損害超過華法林有益效果。但對SIONF而言高脂、高凝狀態(tài)至關重要，有學者提出抗凝、降脂聯(lián)合應用對SIONF的防治或許收益更大[5]。

本研究應用普伐他汀聯(lián)合華法林共同干預兔SIONF動物實驗初步結果顯示，降脂抗凝能降低兔SIONF發(fā)生率，而且沒有明顯的出血傾向發(fā)生，這可能與改善實驗動物體內(nèi)高脂高凝狀態(tài)有關，但SIONF發(fā)生有多種危險因素參與，具體機制仍不明了。再者，Motomura等[11]認為，SIONF 的發(fā)生與個體對激素的“閾值”有關，糖皮質激素使用超過“閾值”才有可能發(fā)生股骨頭壞死。另外，本實驗沒有設立與單用普伐他汀進行比較。這些都值得進一步探討。

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