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    STAT4基因與吉林人群強(qiáng)直性脊柱炎關(guān)聯(lián)研究

    2011-09-14 07:36:28張建佚宋玉國(guó)張吉林朱小泉張玉榮黃慈波霍正浩
    關(guān)鍵詞:吉林分型基因型

    楊 帆 張建佚 周 林 宋玉國(guó) 張吉林 朱小泉 張玉榮 黃慈波 霍正浩 楊 澤

    強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)屬類風(fēng)濕因子陰性慢性進(jìn)行性炎性疾病,主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)及中軸骨骼,也可累及髖關(guān)節(jié)、外周關(guān)節(jié)及韌帶附著點(diǎn)等,可引起椎間盤纖維環(huán)及其附近韌帶鈣化和骨性強(qiáng)直。此病炎癥高度活動(dòng)和低度活動(dòng)相交替,好發(fā)于青少年,發(fā)病者多為10~40歲的男性。黃種人中發(fā)病率為0.2% ~0.5%,男性患者多于女性患者,男女比例為10∶1[1]。強(qiáng)直性脊柱炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前普遍認(rèn)為是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。

    STAT4屬轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)家族,主要被 IL-12激活,在 Th1/Th2的分化調(diào)控及因其失調(diào)引發(fā)的各種炎癥性疾病中有重要的作用。STAT4是Th1細(xì)胞發(fā)育必不可少的,若STAT4缺失可減輕T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎、大腸炎、心肌炎及非肥胖型糖尿病小鼠模型實(shí)驗(yàn)中,與野生型小鼠相比,STAT4缺陷小鼠的炎癥反應(yīng)更輕,且發(fā)病率更低[2,3]。

    我們希望通過(guò)觀察STAT4基因上rs7574865、rs8179673、rs10181656和rs7582694在吉林強(qiáng)直性脊柱炎患者及正常對(duì)照人群之間的分布頻率,以探討 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656與吉林人群強(qiáng)直性脊柱炎患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。

    1.材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 研究對(duì)象 強(qiáng)直性脊柱炎患者來(lái)自北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心,其中男性40名,女性16名,共56名,男女性別比約2∶1,年齡范圍(14~44)歲,平均年齡24歲;56名對(duì)照血液標(biāo)本來(lái)自吉林地區(qū)的無(wú)血緣關(guān)系的健康正常人群,男性43名,女性13名,年齡范圍(39~72)歲,平均年齡46歲。所有病例均符合1985年修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。所有研究對(duì)象均對(duì)該檢測(cè)項(xiàng)目知情同意,并提供外周血用于實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 主要試劑 全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;LC-Green Plus飽和熒光染料購(gòu)自美國(guó)Idaho公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自MBI Fermentas公司。引物由上海生工生物技術(shù)開發(fā)有限公司合成;基因測(cè)序由華大基因測(cè)序部完成。

    1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)MJ公司的PTC-225型PCR儀;高分辨熔解曲線(HRM)基因突變/基因分型檢測(cè)系統(tǒng)為美國(guó)Idaho公司Lightscanner TMHR-I 96;DNA定量分析儀為德國(guó)Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司的Gel DOC-2000成像系統(tǒng)。離心機(jī)為美國(guó)Beckman公司的Allegra TM 21R型離心機(jī)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 基因組DNA提取及定量 取EDTA抗凝的受試者外周血0.5ml,用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA,通過(guò)蛋白/核酸比色儀對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度的分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果將樣本DNA稀釋至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

    1.2.2 基因分型方法 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高分辨率熔解曲線(PCR-HRM)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性位點(diǎn)多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù),并結(jié)合測(cè)序驗(yàn)證分型結(jié)果。rs7574865、rs8179673和rs7582694位點(diǎn)用PCR-HRM技術(shù)進(jìn)行分型,rs10181656位點(diǎn)用傳統(tǒng)的 PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行分型。

    1.2.3 引物合成 從Genebank中查得這4個(gè)SNPs位點(diǎn)上下游序列,通過(guò)Oligo 6.0和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。rs7574865引物序列為:F:5'-AATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAA -3',R:5'-CCCTGAAATTCCACTGAAATAAGAT -3';rs8179673引物序列為:F:5'-CTGCCATAGAAGTCTTTGAAGC-3',R:5'-GATGATGATGTGTATGGTGGTT-3';rs10181656引物序列為:F:5'-ACTGTGATAGATAACTAGCTGGAAT-3',R:5'-AAAGCAGGGAACGAGGAAGAT-3';rs7582694引物序列為:F:5'-CCTTCCAATGGTTTCTCATTTCAA -3',R:5'- AAAGAACAAGCAAACATGCATAG -3';低溫內(nèi)參:F:5'-TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA - 3',R:5'- TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-3';高溫內(nèi)參:F:5'-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG -3',R:5'-CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-3'。寡核苷酸內(nèi)參末端用C3封閉,以阻止延伸反應(yīng)。

    1.2.4 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系均為10μl。HRM用PCR 體系含:模板 DNA 1μl,10 × PCR Buffer 1μl,dNTP(10mmol/L)0.2μl,Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl,上下游引物各(10pmol/μl)0.1μl,上下游高低溫內(nèi)參各 0.05μl,1 × LC-Green Plus飽和熒光染料 1μl及雙蒸水 6.2μl。RFLP 用PCR 體系包含:模板 DNA 1μl,10 × PCR Buffer 1μl,dNTP(10mmol/L)0.2μl,Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl,上下游引物各0.1μl及雙蒸水7.4μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入主循環(huán),95℃變性30s,退火,72℃延伸(rs7574865退火溫度為61℃,退火時(shí)間為20s,延伸時(shí)間為7s;rs8179673退火溫度為 52℃,退火時(shí)間為 25s,延伸時(shí)間為 12s;rs10181656退火溫度為61℃,退火時(shí)間為30s,延伸時(shí)間為30s;rs7582694退火溫度為53℃,退火時(shí)間為25s,延伸時(shí)間為12s),總共35個(gè)循環(huán),完成后72℃延伸7min。之后用HRM技術(shù)分型的樣本需進(jìn)行變性和復(fù)性處理,程序?yàn)?95℃ 30s,25℃ 2min,94℃ 30s,24℃ 4min。rs7574865 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)56bp,rs8179673 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)104bp,rs10181656 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)101bp,rs7582694 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)120bp。

    1.2.5 HRM檢測(cè) 將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi),在Light Scanner TMHR-I 96上進(jìn)行HRM分析:從45℃開始,以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線,到98℃結(jié)束,用Light Scanner Call IT軟件對(duì)采集后的曲線進(jìn)行分析,判定基因型。

    1.2.6 RFLP分型 PCR產(chǎn)物經(jīng)8%PAGE電泳后,凝膠成像觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果,符合要求后,用DdeⅠ酶進(jìn)行酶切,時(shí)間控制在7~8小時(shí)。酶切完成后8%PAGE電泳,凝膠成像觀察分型結(jié)果。酶切體系共 10μl,其中包括:Buffer 1μl,DdeⅠ酶0.3μl,雙蒸水5.7μl和 PCR 產(chǎn)物3μl。

    1.2.7 測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)HRM分析的不同曲線及酶切結(jié)果確定不同的基因型。從所得的不同基因型的個(gè)體中分別隨機(jī)抽取5例樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序樣本重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)序用PCR引物與PCR反應(yīng)所用引物相同。PCR反應(yīng)體系 50μl,包含:DNA 模板 5μl,10 × PCR Buffer 5μl,10 mmol/L dNTP 1μl,Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl,上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl,去離子水補(bǔ)充總體積至50 μl。PCR反應(yīng)條件與第一次PCR條件相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后送華大基因測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性。用比數(shù)比(OR)值及其95%可信區(qū)間(95%CI)來(lái)評(píng)價(jià)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

    2.結(jié)果

    2.1 STAT4基因分型結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)HRM分析后,可根據(jù)樣本的熔解曲線差異,將所有樣本分為3個(gè)組。3組之間的熔解曲線差異非常明顯,見圖1。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上BLAST比對(duì),序列完全一致。rs10181656PCR產(chǎn)物經(jīng)DedⅠ酶切后,GG型為兩個(gè)條帶,分別長(zhǎng)66bp和35bp;GC型為三個(gè)條帶,分別長(zhǎng) 101bp、66bp和 35bp;CC型為一個(gè)條帶,長(zhǎng)101bp,見圖2。HRM及RFLP分型結(jié)果與測(cè)序的結(jié)果完全吻合,準(zhǔn)確率為100%,測(cè)序圖見圖2。

    2.2 STAT4基因型和等位基因頻率在病例組及正常對(duì)照中的分布 用SPSS 16.0軟件對(duì)STAT4基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)rs7574865、rs8179673、rs10181656及rs7582694在病例和對(duì)照中基因型和等位基因頻率分布進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)無(wú)顯著性差異(P >0.05),見表1。

    2.3 STAT4基因單倍型頻率和風(fēng)險(xiǎn)分析 用SHEsis在線軟件將這4個(gè)SNPs組成的單倍型進(jìn)行頻率和風(fēng)險(xiǎn)分析后,結(jié)果只有rs8179673和rs10181656組成的單倍型TG在病例和對(duì)照中分布具有顯著性差異(P=0.045;OR=3.126,95%CI:0.973~10.044),見表2。

    表1 吉林人群中STAT4基因型和等位基因頻率分布比較

    表2 STAT4基因單倍型頻率和風(fēng)險(xiǎn)分析

    續(xù)表2

    3.討論

    STAT4基因定位于2q32.2-32.3,全長(zhǎng)121kb,含24個(gè)外顯子,編碼序列(CDS)區(qū)由2247個(gè)連續(xù)核苷酸組成,編成748個(gè)氨基酸。STAT4具有STAT家族其他成員相似的蛋白結(jié)構(gòu),均由C端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū),近C端的Src同源結(jié)構(gòu)域及所有STAT共有的701氨基酸上的酪氨酸位點(diǎn),中部的DNA結(jié)合域及N端保守區(qū)等幾部分構(gòu)成。但STAT4的表達(dá)譜不及其他STAT蛋白廣泛,主要分布在淋巴和髓系組織中。STAT4主要由 IL -12 激活,但也可被 IFN - α/β,IL -23 激活[5,6]。IL-12與受體(IL-12R)特異性結(jié)合,IL-12R發(fā)生二聚化,激活JAK,繼而受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈特定區(qū)域酪氨酸位點(diǎn)磷酸化,招募STAT4單體,JAK對(duì)STAT4單體產(chǎn)生激活作用?;罨蟮腟TAT4形成同源二聚體,并穿越核膜識(shí)別DNA上的特定靶序列,啟動(dòng)特異的基因轉(zhuǎn)錄,從而增加IFN-γ的產(chǎn)生[7]。

    Zervou等發(fā)現(xiàn)rs7574865突變等位基因T,一個(gè)之前曾報(bào)道與許多自身免疫性疾病有關(guān)的等位基因,在銀屑病患者中要比在對(duì)照中更普遍,因此推論rs7574865多態(tài)性與希臘銀屑病的發(fā)生有關(guān)[8]。Ji JD等進(jìn)行的 meta分析說(shuō)明rs7574865與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡顯著關(guān)聯(lián)[9]。另外許多研究已報(bào)道STAT4是與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及Ⅰ型糖尿病關(guān)聯(lián)的易感基因[10~13]。

    為探討STAT4這4個(gè)SNPs與吉林人群AS發(fā)生的關(guān)系,我們采用病例 -對(duì)照設(shè)計(jì),應(yīng)用 PCR-HRM技術(shù)檢測(cè)rs7574865、rs8179673和 rs7582694,用 PCR -RFLP技術(shù)檢測(cè)了rs10181656多態(tài)性在吉林AS病例組與正常對(duì)照組之間的分布情況。在本研究中,我們對(duì)病例組和正常對(duì)照組的基因型頻率進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05),表明我們所選擇的群體具有很好的代表性。我們用基因片段測(cè)序技術(shù)對(duì)PCR-HRM和PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證和質(zhì)量控制,準(zhǔn)確率100%,基因分型結(jié)果穩(wěn)定可靠。

    本研究結(jié)果顯示,rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656位點(diǎn)的各種基因型頻率及各等位基因頻率在吉林AS病例組與正常對(duì)照組之間的分布均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。本研究結(jié)果表明 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656可能與吉林人群AS的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)。但經(jīng)多位點(diǎn)單倍型頻率分布分析后發(fā)現(xiàn),rs8179673和rs10181656位點(diǎn)組成的單倍型TG在病例和對(duì)照中分布具有顯著性差異(P=0.045;OR=3.126,95%CI:0.973 -10.044)。因此,我們可以推斷在rs8179673和rs10181656之間的連鎖區(qū)域內(nèi)或其周圍序列中可能存在與AS真正關(guān)聯(lián)的變異。

    限于本研究所涉及的樣本數(shù)量有限,本次研究未發(fā)現(xiàn)STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性,但本研究結(jié)果尚不能確定STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生之間的確切關(guān)系。

    對(duì)于STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生相關(guān)性的最終結(jié)論,還需在其他群體及更大樣本中進(jìn)一步探索,以便為AS的病因?qū)W研究、診斷及治療提供理論依據(jù)。

    附圖

    圖1 HRM分析rs7582694,灰色為GC型,紅色為GG型,為CC型

    圖2 rs10181656 位點(diǎn) PCR 產(chǎn)物酶切電泳圖,1、3、5、7、8、9、10、11為 GC 型(101bp、66bp和35bp),12為 GG 型(66bp和35bp),2、4、6為 CC 型(101bp)

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