COX-2抑制劑對PC-3細胞的放射增敏作用研究

宋軼鵬 臧茹琨 馬金波

胰腺癌是一種常見的消化道腫瘤，因其解剖位置的特殊性，目前放療效果尚不盡人意。放射增敏劑作為提高放療效果的一個重要途徑，業(yè)已成為研究熱點。新近發(fā)現誘導型環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑在體內外都有放射增敏作用［1，2］，然其確切增敏機制尚未明確。本研究探討COX-2抑制劑NS-398對胰腺癌細胞系PC-3的放射敏感性影響，并初步研究其可能增敏機制。

1.材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司;小牛血清為杭州四季青產品;MTT、DMSO、NS-398均為Sigma產品;NS-398溶于DMSO中，現配現用。Trizol為Invitrogen公司產品;RevertAid first strand cDNA Synthesis試劑盒為MBI產品;PCR試劑盒購自大連寶生物公司;引物為上海伯亞公司合成;FITC標記的鼠抗人COX-2單克隆抗體以及用于免疫陰性對照的IgG-FITC均為美國Pharmingen產品;胰腺癌細胞株PC-3為齊魯醫(yī)院腫瘤防治中心保存。

1.2 細胞培養(yǎng) PC-3為貼壁細胞，將細胞接種于含雙抗的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗選取對數生長期細胞。

1.3 FCM檢測COX-2蛋白表達 收集未處理細胞，用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人COX-2單克隆抗體標記細胞后上機檢測，以標記陽性細胞百分率表示表達水平。

1.4 MTT實驗檢測藥物毒性及適宜濃度 將細胞以105/孔接種96孔板，24小時后開始藥物實驗，NS-398設0，10，50，100μmol/L 4 個濃度組，每個濃度組各取 12，24，48，72小時四個時間點檢測，設不接種細胞的空白對照和只含1‰DMSO的對照，每濃度每時間點重復4孔。采用MTT法在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570nm處吸光度值(A)，細胞存活率(%)=實驗孔A值/對照孔A值×100%。

1.5 MTT實驗分析放射增敏效應 制備單細胞懸液，根據不同照射劑量接種適量細胞于75mm2培養(yǎng)皿中，實驗分兩組:①單照組;②聯(lián)合組:照射+NS-398處理。細胞接種24小時貼壁，聯(lián)合組更換含10μmol/L的NS-398培養(yǎng)液，兩組繼續(xù)培養(yǎng)24小時，室溫下分別接受0，2，4，6Gy的6MV X-ray照射，照射后聯(lián)合組更換無藥培養(yǎng)液與單照組一起繼續(xù)培養(yǎng)48小時。采用MTT法在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570nm處吸光度值(A)，求細胞存活率及IC50值(50%細胞殺傷所需放射劑量)。

1.6 FCM分析細胞周期 實驗細胞分四組:未處理組、單照組(2Gy)、單藥組(10μmol/L NS-398)及聯(lián)合組(2Gy+10μmol/L NS-398)。各組離心收集20，000個細胞，PBS洗2次，加入預冷的70%的乙醇4℃固定過夜，離心棄乙醇，PBS洗1次，RNaseA(50μg/ml)37℃消化45分鐘，碘化丙啶4℃避光染色30分鐘，100目篩網過濾，上機檢測。

1.7 RT-PCR檢測P21 mRNA表達 實驗細胞同上分四組，按Trizol(Invitrogen公司)試劑說明書提取細胞總RNA。逆轉錄反應體系為 20μl，總 RNA 1μg，隨機六聚體引物 1μl，反轉錄酶1μl，具體步驟參照RevertAid first strand cDNA Synthesis Kit(MBI公司)說明書進行。PCR擴增時，將目的基因(bax/bcl-2)與管家基因(β-Actin)同管擴增。PCR反應體系為50μl，取2μl逆轉錄反應產物作為模板，反應條件為:94℃，2分鐘預變性后，94℃ 45sec，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個循環(huán)后，72oC延伸10分鐘，終止反應。取擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，掃描存盤，凝膠圖像分析儀測定電泳條帶的灰度，將目的基因與管家基因陽性條帶的灰度比值作為目的基因表達水平的參數。引物序列:

P21F:5'ATGTCAGAACCGGCTGGGGA3';R:5'GCCGTTTTCGACCCTGAGAG3'

β-actin F:5'CGCTGCGCTGGTCGTCGACA3';R:5'GTCACGCACGATTTCCCGCT3'

2.結果

2.1 COX-2在PC-3細胞內的表達 FCM檢測結果顯示PC-3細胞COX-2表達的熒光強度為101.49，陽性細胞百分數為81.3%，提示PC-3細胞COX-2表達陽性，存在COX-2抑制劑作用的靶(圖1)。

圖1 流式細胞術檢測PC-3細胞COX-2表達

2.2 NS-398對PC-3細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示:10uM的NS-398即可影響PC-3細胞的活性，藥物的增殖抑制作用于加藥后12小時即可顯現，且隨NS-398濃度的增加和作用時間的延長而增強，存在明顯的時效和量效關系(圖2)。

圖2 NS-398對PC-3細胞增殖的影響

2.3 NS-398對PC-3細胞放射敏感性的影響 MTT實驗結果顯示:隨著照射劑量的增加，PC-3細胞的存活率明顯降低，聯(lián)合組尤為顯著。當照射劑量為2GY時，細胞存活率率由單照組的78.45%±3.46%下降到聯(lián)合組的57.42%±2.58%(P＜0.05);劑量生存曲線明顯左移，IC50值從單照組的6.0GY下降到聯(lián)合組的2.9GY，增敏值為2.07(圖3)。

圖3 NS-398聯(lián)合放射對PC-3細胞增殖的影響

2.4 NS-398誘導細胞周期改變 FCM顯示各組細胞周期分布如表1。單處理組(單藥組和單照組)較未處理組G0-G1期比率明顯上調(P＜0.05)。聯(lián)合組較單處理組比率進一步上調(P＜0.05)。

表1 NS－398誘導PC－3細胞周期改變

2.5 細胞周期相關蛋白P21 mRNA表達 四組細胞P21 mRNA表達結果顯示:對照組、單藥組、單照組、聯(lián)合組P21 mRNA/β -actin mRNA 灰度值分別為 0.19，0.48，0.37，0.71。其灰度值單處理組顯著高于未處理組(P＜0.05)，聯(lián)合組顯著高于單處理組(P＜0.05)，即NS-398和放射均可引起P21mRNA表達上調，兩者聯(lián)合表達進一步上調。

3.討論

環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是近年來國內外研究的熱點。已有研究顯示COX-2在許多腫瘤中高表達，推測與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移密切相關。抑制COX-2的表達和(或)對抗COX-2的活性可以阻滯COX-2的促癌作用［3，4］，提示COX-2可能成為腫瘤診治的一個新靶點。

業(yè)已證實COX-2抑制劑具有抑制腫瘤生長的作用，分析其機制為抑制腫瘤血管生成、誘導癌細胞凋亡等［5］。研究還發(fā)現COX-2抑制劑能增強腫瘤的放射敏感性［6］，其具體增敏機制目前尚無定論，可能與下調COX-2表達，從而降低細胞內 PGE2 水平［7］;抑制細胞增殖和促進凋亡［2，8］;誘導細胞周期的阻滯［9］;抑制放射引起DNA 損傷的修復［10］;抑制腫瘤血管生成［11，12］等相關。本研究發(fā)現COX-2選擇性抑制劑NS-398能顯著增強胰腺癌細胞株PC-3的放射敏感性。

本研究應用流式細胞術(FCM)單抗標記技術檢測胰腺癌細胞株PC-3的COX-2表達水平，證實存在COX-2的異常高表達，與文獻報道一致［13］?；诖?，研究了COX-2抑制劑NS-398對PC-3細胞的增殖抑制作用及放射增敏作用，結果發(fā)現，(10～100)μmol/L濃度的NS-398對PC-3細胞均有增殖抑制作用，且呈時間與劑量依賴性;NS-398聯(lián)合放射組的細胞生存率較單照組明顯降低，即NS-398對PC-3細胞具有明顯的放射增敏作用，這與徐剛等［13］的報道結果一致。

本研究發(fā)現，NS-398和放射均可誘導G0-G1期比率上調，兩者聯(lián)合起協(xié)同作用，表明NS-398和放射均可誘導PC-3細胞周期的改變，引起部分細胞阻滯于G0-G1期。由此推測，NS-398對PC-3細胞的放射增敏效應可能與改變細胞周期分布相關。Ma等［1］亦報道COX-2抑制劑塞來昔布對CD133(+)膠質瘤細胞的放射增敏效應可能與其改變細胞周期分布相關。Bijnsdorp等［14］報道，COX-2抑制劑美洛昔康亦可改變腦膠質瘤細胞株D384細胞周期分布，同時具有放射增敏作用，然而兩者可能無必然相關性，認為放射增敏主要與美洛昔康直接導致細胞死亡相關。而Ohneseit等［15］則報道，COX-2抑制劑塞來昔布單獨和聯(lián)合放射均不改變前列腺癌細胞株PC-3的細胞周期分布，也不具放射增敏作用。Palayoor等［16］通過siRNA干擾技術沉默前列腺癌PC-3細胞COX-2基因，發(fā)現COX-2基因的沉默并不改變細胞周期的分布，推測PC-3細胞的放射敏感性可能并不依賴于COX-2的表達狀態(tài)，即COX-2抑制劑可能無法通過COX-2依賴途徑增加PC-3細胞的放射敏感性?？梢奀OX-2抑制劑的放射增敏機制及與細胞周期分布的相關性十分復雜，可能與是否COX-2依賴相關，當然存在其他復雜因素，相關研究有待進一步進行。

P21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKIs)，是細胞周期調控的物質基礎之一。P21可與cyclin-CDK復合物結合，抑制其cyclinD1-CDK4和cyclinE-CDK2的活性，使Rb蛋白不能發(fā)生磷酸化，從而使細胞周期停滯在G1期。放射誘導DNA損傷后能轉錄性地激活P53基因的表達，進而激活其下游靶基因P21的表達。陳志剛等［17］已報道放療可引起腦膠質瘤細胞U87MG P21蛋白表達的增加。陳其奎等［18］已報道NS-398誘導細胞周期相關蛋白P21轉錄和表達的升高，并誘導部分細胞阻滯在G0-G1期。本研究應用RTPCR檢測P21mRNA表達水平，發(fā)現NS-398和放射均可誘導P21mRNA表達，兩者具協(xié)同作用。

綜上所述，本研究結果提示NS-398能增加胰腺癌細胞株PC-3對放射的敏感性，其增敏機制可能與上調P21mRNA表達，進而誘導細胞周期阻滯于G0-G1期相關，更深入的研究有待進一步進行。

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