SIRT1在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中的保護(hù)作用1）

秦花萍，司沛沛，楊小榮，張 策

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)各種興奮性突觸傳遞。在胚胎期神經(jīng)發(fā)育、成年腦的各種興奮性突觸傳遞、突觸的可塑性等方面發(fā)揮重要作用［1］。然而，谷氨酸在突觸間隙的過度聚集可引起神經(jīng)元損傷甚至死亡，被稱為興奮性神經(jīng)毒。興奮性神經(jīng)毒參與多種神經(jīng)病理過程，如腦缺血損傷和各種神經(jīng)退行性疾病等。而興奮性神經(jīng)毒模型是最常用（被普遍公認(rèn)）、最具毒性（既可引起壞死，也可引起凋亡）、損傷機(jī)制最復(fù)雜（涉及氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞壞死及凋亡等）、最具臨床意義（興奮性神經(jīng)毒參與了幾乎所有神經(jīng)病理過程，如腦缺血損傷，各種神經(jīng)退行性疾病等）的一個(gè)神經(jīng)損傷模型［1，2］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）作為一種依賴于煙堿腺嘌呤二核苷酸（nicotine－amid adenine dinucleotide，NAD）的去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。SIRT1可以作用于組蛋白和非組蛋白使其去乙?；瑥亩诙喾N生物活動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用，包括參與基因轉(zhuǎn)錄、物質(zhì)代謝、胰島素分泌、血管生成以及細(xì)胞衰老過程的調(diào)節(jié)［3－7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。但SIRT1在N－甲基－D－門冬氨酸（N－methyl－D－aspartate，NMDA）誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中是否發(fā)揮保護(hù)作用尚不明確。因此本研究采用NMDA（100 μmol／L，2h）誘導(dǎo)的興奮毒細(xì)胞模型，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒－8（CCK－8）分析，乳酸脫氫酶 （LDH）檢測以及 Calcein－AM 和 PI雙染等方法檢測細(xì)胞損傷，同時(shí)使用SIRT1激活劑白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）和 SIRT1抑制劑 Sirtinol，觀察 SIRT1在NMDA介導(dǎo)毒性過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 Neurobasal，B27添加劑購自Gibco，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒－8購自Dojindo，LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所，SIRT1激活劑白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）和SIRT1抑制劑Sirtinol購自Sigma。1.2 方法

1.2.1 原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生1d～3d的小鼠，常規(guī)手術(shù)，分離制成小鼠皮層單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液經(jīng)1 000g離心5 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按5×104個(gè)／mL的濃度，在37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 NMDA毒性誘導(dǎo) 采用 NMDA（100μmol／L）和Gly（10μmol／L）與培養(yǎng)神經(jīng)元共孵育2h，再進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞活力檢測。SIRT1激活劑白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）在NMDA誘導(dǎo)之前預(yù)孵育12h，SIRT1抑制劑Sirtinol在白藜蘆醇孵育前2 h加入。

1.2.3 CCK－8法 將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)NMDA進(jìn)行毒性誘導(dǎo)后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在每孔加入10μL的CCK－8，再繼續(xù)培養(yǎng)2h，最后用酶標(biāo)儀測定490nm吸光度值。

1.2.4 LDH檢測 將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板上，經(jīng)NMDA毒性誘導(dǎo)后，繼續(xù)培養(yǎng)24h（即NMDA開始作用后的24h），收集培養(yǎng)液進(jìn)行LDH活性的檢測。

1.2.5 Calcein－AM和PI染色 將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板上，經(jīng)NMDA毒性誘導(dǎo)后，繼續(xù)培養(yǎng)24h（即NMDA開始作用后的24h），在蓋玻片上滴加Calcein－AM和PI溶液，37℃下孵育20min，PBS洗滌兩次。隨后用共聚焦顯微鏡（Olympus，F(xiàn)V21000）在激發(fā)波490nm和發(fā)射波515nm條件下拍攝照片，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 RSV對NMDA引起的細(xì)胞活力下降的作用觀察 預(yù)先應(yīng)用SIRT1抑制劑Sirtinol（10μmol／L）與神經(jīng)元預(yù)孵育2h，之后加入SIRT1激活劑RSV（25μmol／L）再孵育12h，采用CCK－8檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，RSV可有效抑制NMDA引起的細(xì)胞活力下降，使細(xì)胞活力恢復(fù)31.92%（P＜0.05）；Sirtinol可以有效阻斷RSV使細(xì)胞活力恢復(fù)的作用。詳見圖1。

圖1 RSV和Sirtinol對NMDA引起細(xì)胞活力下降的影響

2.2 RSV對NMDA引起的LDH釋放的作用觀察 在進(jìn)行LDH的實(shí)驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比NMDA組的LDH水平增高了116.03%（P＜0.05）；RSV（25μmol／L）使 NMDA誘導(dǎo)釋放的LDH減少27.34%（P＜0.05）；Sirtinol（10μmol／L）取消了RSV減少LDH釋放的作用。MK－801完全阻斷NMDA的作用。詳見圖2。

圖2 RSV對NMDA引起的LDH釋放的作用觀察

2.3 RSV對NMDA引起的活細(xì)胞下降的作用觀察 在利用Calcein－AM和PI免疫組織化學(xué)雙染進(jìn)行的活細(xì)胞標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)，NMDA引起存活神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，約為對照組的53.37%（P＜0.05）；與 NMDA組相比，RSV（25μmol／L）使活細(xì)胞數(shù)目增加18.9%（P＜0.05）；同時(shí) Sirtinol（10 μmol／L）抑制了RSV使活細(xì)胞數(shù)目增多的作用；此外 MK－801完全阻斷NMDA的作用。詳見圖3。

圖3 RSV對NMDA引起的活細(xì)胞下降的作用觀察

3 討 論

谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)過度激活突觸后膜NMDA受體時(shí)，使胞外的Ca2＋內(nèi)流引起一系列Ca2＋依賴的重要事件，如各種蛋白酶及蛋白激酶激活、過度產(chǎn)生的自由基，這些因素共同作用，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，直到細(xì)胞死亡，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒效應(yīng)［8］。

大約70多年前，人們就發(fā)現(xiàn)限制熱量攝入可以延長大鼠壽命，后來在線蟲、蠕蟲、果蠅、芽殖酵母等物種中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象［9］。此后的研究證實(shí)，熱量限制（calorie restriction，CR）延長酵母及嚙齒動(dòng)物壽命，推遲哺乳動(dòng)物年齡相關(guān)的疾病如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病的發(fā)生，是通過增加去乙?；窼irtuin活性而起作用。存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的這類酶被稱作Sirtuins家族，是一種依賴于煙堿腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?。其中SIRT1是SIRTUINS家族中研究最為深入的一個(gè)成員。現(xiàn)有的研究提示，CR延長哺乳動(dòng)物壽命的機(jī)制至少部分通過激活SIRT1。由于SIRT1基因的高度保守和CR延長壽命的廣泛性，推測在人類激活SIRT1可能也有延長壽命的作用。SIRT1可以作用于組蛋白和非組蛋白使其去乙?；?，從而在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括參與基因轉(zhuǎn)錄、物質(zhì)代謝、胰島素分泌、血管生成、神經(jīng)保護(hù)以及細(xì)胞衰老過程的調(diào)節(jié)［3－7］。

在猴的阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）動(dòng)物模型中，高表達(dá)SIRT1能減少腦內(nèi)的β淀粉樣蛋白（amyloid－β，Aβ），且腦內(nèi)Aβ含量與同一區(qū)域的SIRT1含量呈負(fù)相關(guān)［10］。體外研究表明，SIRT1對諸多底物如p53、FOXOs、Ku70、PGC－1α、TAFI68、P300、PCAF等均具有很強(qiáng)的去乙酰化作用。從這些去乙?；孜锏纳碜饔猛茰y，SIRT1可能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和物質(zhì)代謝等過程［11］。相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察顯示，SIRT1可通過使p53特異位點(diǎn)的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；饔脧亩?fù)性調(diào)節(jié)其活性，使細(xì)胞免于凋亡，繼續(xù)分裂生長［12］；通過使FOXO3a以及其他forkhead家族成員發(fā)生去乙?；饔靡种破滢D(zhuǎn)錄調(diào)控作用，起到促存活抗凋亡的作用［13］；通過對DNA修復(fù)蛋白Ku70的去乙?；饔靡种艬ax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14］。另外，SIRT1也能通過抑制NF－κB的活性，拮抗Aβ對神經(jīng)元的損傷作用［15］。Okawara等［16］的研究表明，白藜蘆醇可以減少由神經(jīng)毒素（MPP＋）誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元毒性作用，并且可能是通過激活SIRT1發(fā)揮的保護(hù)作用。在應(yīng)用Wallerian慢性退化模型（Wlds）的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1對神經(jīng)元的損傷亦有保護(hù)作用。當(dāng)抑制SIRT1活性后，神經(jīng)元損傷加劇，而用白黎蘆醇激活SIRT1后，神經(jīng)元的損傷明顯減少［17］。此外，SIRT1還可能參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，如SIRT1通過對PGC－1α的去乙?；?，激活肝臟糖異生抑制糖酵解［18］；還能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR－γ），可以在熱量攝入減少的情況下，促進(jìn)脂肪動(dòng)員［19，20］。上述結(jié)果提示，SIRT1可能通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性，一方面參與調(diào)節(jié)細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活與死亡的平衡，另一方面參與代謝的調(diào)節(jié)?？傊?，作為一種進(jìn)化上相對保守的蛋白，SIRT1發(fā)揮了一些最為基本而廣泛的蛋白修飾功能，從而參與能量代謝調(diào)節(jié)過程，保持基因組的穩(wěn)定性，因而使SIRT1具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)功能，同時(shí)具有延緩衰老及延長生命的作用。

本實(shí)驗(yàn)中利用NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒模型，觀察SITR1在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中的保護(hù)作用。為觀察SIRT1可能具有的神經(jīng)保護(hù)作用，應(yīng)用了SIRT1的激動(dòng)劑RSV。RSV是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。廣泛存在于葡萄、松樹、虎杖、決明子和花生等天然植物或果實(shí)當(dāng)中，具有抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、影響壽命等多方面有益于人類健康的重要功能，因而引起學(xué)者的高度重視［21］。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以在多種生物體內(nèi)模擬CR的作用，因此被認(rèn)為是CR的模擬物。目前，在進(jìn)行SIRT1的作用觀察過程中，普遍使用RSV作為其激動(dòng)劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用SIRT1激動(dòng)劑RSV能夠拮抗NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加、LDH釋放減少，同時(shí)利用Calcein－AM和PI染色觀察到活細(xì)胞數(shù)明顯增加。而SIRT1抑制劑Sirtinol能夠阻斷RSV對NMDA損傷的抑制效應(yīng)（保護(hù)效應(yīng)），說明RSV的保護(hù)作用是通過活化SIRT1而實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，在NMDA引起的神經(jīng)毒過程，SIRT1的作用可能受到抑制，由此參與神經(jīng)損傷；而激活SITR1可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。NMDA興奮性神經(jīng)毒參與多種神經(jīng)病理過程，如腦缺血損傷和各種神經(jīng)退行性疾病等［1，2］。

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