氨海水與5-羥色胺對(duì)櫛孔扇貝解剖卵的體外促熟作用

邸煒鵬,王昭萍,于瑞海,周珊珊,顧玲玲,李 寧

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

氨海水與5-羥色胺對(duì)櫛孔扇貝解剖卵的體外促熟作用

邸煒鵬,王昭萍＊＊,于瑞海,周珊珊,顧玲玲,李 寧

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

研究氨海水與5-羥色胺(5-HT)對(duì)櫛孔扇貝解剖獲得卵母細(xì)胞的促熟作用。通過(guò)體外浸泡的方法處理櫛孔扇貝卵母細(xì)胞使其成熟,并完成人工受精。結(jié)果表明一定濃度的氨海水可顯著促使櫛孔扇貝卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂,但經(jīng)過(guò)氨處理的卵母細(xì)胞受精率卻不高;5-羥色胺不能誘導(dǎo)櫛孔扇貝卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂,但可有效地使已經(jīng)發(fā)生生發(fā)泡破裂的卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟。先用氨海水處理然后用5-羥色胺處理可以得到最佳誘導(dǎo)效果,受精率可達(dá)(40.02±2.73)%。

櫛孔扇貝;體外成熟;氨海水;5-羥色胺

雙殼貝類的繁育過(guò)程中,常采用解剖取卵、人工授精的方法,以避免精液過(guò)多的現(xiàn)象[1]。然而,貝類的卵子多是分批成熟分批產(chǎn)出的,解剖獲得的卵子存在成熟度不夠及發(fā)育不同步現(xiàn)象,對(duì)其進(jìn)行體外促熟是必要的。

目前關(guān)于貝類解剖卵的體外促熟研究報(bào)道不多,僅見(jiàn)于太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[2]、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)[3]、紫扇貝(A rgopecten purpuratus)[4]、硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)[5]、浪蛤(S pisula)[6]等幾種貝類中。已有的研究結(jié)果表明海水浸泡、維生素、氨海水(Ammonia Seawater,AS)、5-羥色胺(5-HT)、組胺等對(duì)貝類的解剖卵都有一定的促熟作用。

櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)是我國(guó)北方重要的養(yǎng)殖貝類,因其解剖卵無(wú)法完成受精作用,卵子都是通過(guò)自然產(chǎn)出或誘導(dǎo)排放的途徑獲得,迄今未有其解剖取卵、體外促熟的報(bào)道。本研究采用氨海水和5-羥色胺(5-HT)對(duì)櫛孔扇貝的解剖卵進(jìn)行體外促熟研究,通過(guò)對(duì)生發(fā)泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD)情況和受精情況的分析來(lái)衡量2種試劑的促熟作用,探索扇貝解剖取卵、人工受精的可行性,最后通過(guò)氨和5-羥色胺的雙因子處理建立了櫛孔扇貝解剖獲卵的體外促熟技術(shù),該技術(shù)將在櫛孔扇貝的繁殖和遺傳操作中得到應(yīng)用,并且對(duì)于建立相關(guān)類型貝類卵母細(xì)胞的體外促熟技術(shù)均有借鑒。

1 材料與方法

1.1 精卵的獲得

實(shí)驗(yàn)用櫛孔扇貝親貝為青島海區(qū)養(yǎng)殖的成熟2齡貝(殼長(zhǎng)6.19 cm±0.5 cm,殼寬2.24 cm±0.2 cm,殼高6.65 cm±0.6 cm,體質(zhì)量54.86 g±3.5 g)。

親貝經(jīng)過(guò)暫養(yǎng)穩(wěn)定后,挑選發(fā)育良好的親貝,解剖獲得精卵[7]。將卵液用100目篩絹濾去較大組織塊后,再用500目篩絹去除組織液和微小雜質(zhì);精液用300目篩絹過(guò)濾,選用上層,并檢查精子活性。

1.2 卵母細(xì)胞的促熟

室溫(20℃)下,在幾支15 mL試管中加入等量卵液,再加入等量不同濃度的處理液,控制卵密度為500～1 000個(gè)/mL,搖勻計(jì)時(shí)。

氨海水單獨(dú)處理時(shí),處理濃度梯度設(shè)定為: 0.0025%、0.005%、0.01%、0.015%、0.020%和0.025%(以分析純氨水25%～26%為100%)。處理時(shí)間梯度為:15、30、45和60 min。

5-羥色胺單獨(dú)處理時(shí),處理濃度梯度設(shè)定為: 0.001、0.002、0.003和0.004 mol/L。處理時(shí)間梯度為:15、30、45和60 min。

聯(lián)合處理時(shí),選取前面2組中較好的濃度加以混合,并根據(jù)情況特別添加了先用氨海水浸泡再用5-羥色胺浸泡的處理組(T組)。處理時(shí)間同上。

選用在正常海水中浸泡的卵母細(xì)胞作為對(duì)照,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組。

1.3 人工授精

取出處理完畢的卵液,用500目篩絹過(guò)濾,洗去處理液,加入5 mL小瓶中,再滴入1～2滴活力旺盛的精子,搖勻。受精過(guò)程中盡量多晃動(dòng)。

1.4 觀察記錄GVBD發(fā)生率、受精率

受精2～3 h后,取樣進(jìn)行顯微拍照,照片用于計(jì)算GVBD發(fā)生率、受精率。

GVBD發(fā)生率=發(fā)生GVBD的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%;

受精率=正常卵裂的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%;

相對(duì)GVBD發(fā)生率=處理組GVBD發(fā)生率-海水組GVBD發(fā)生率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

最后的數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙因子方差分析,以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 卵母細(xì)胞一系列形態(tài)變化

通過(guò)解剖獲得的櫛孔扇貝卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)海水浸泡,生發(fā)泡依然未破裂(見(jiàn)圖1A),有時(shí)也有例外(見(jiàn)2.3);處理后櫛孔扇貝卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD(見(jiàn)圖1B);體外促熟的卵母細(xì)胞受精后,部分可以正常發(fā)育(見(jiàn)圖1C);部分卵子促熟效果不明顯,呈現(xiàn)不受精、發(fā)育過(guò)慢、發(fā)育畸形等情況(見(jiàn)圖1D)。

圖1 櫛孔扇貝剝離卵的形態(tài)變化Fig.1 Morphology changes of oocyte stripped from scallop,Chlamys f arrer

2.2 氨海水對(duì)卵母細(xì)胞的促熟作用

氨海水可以顯著地促使櫛孔扇貝卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(見(jiàn)圖2),除氨0.0025%組之外,其它濃度都達(dá)到了100%的GVBD發(fā)生率,海水對(duì)照組僅為6%,差異極顯著(P<0.01)。

卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)氨海水處理后受精,如圖3,除個(gè)別組與海水對(duì)照差異不顯著外,都能極顯著的提高受精率(P<0.01)。氨0.002 5%處理組體現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系,隨著時(shí)間從15 min增加到45 min受精率呈增長(zhǎng)趨勢(shì),差異極顯著(P<0.01),其它濃度處理沒(méi)有時(shí)間依賴關(guān)系(P>0.05);相同的時(shí)間處理下,表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系,15和30 min時(shí),氨0.005%與0.01%處理組受精率都高于其它組,差異極顯著(P< 0.01),45和60 min時(shí),氨0.005%處理組受精率高于其它組,差異顯著(P<0.05)。

氨海水最佳處理?xiàng)l件基本確定為:氨0.005%濃度,在處理時(shí)間15、30、45和60 min時(shí)受精率分別達(dá)到了(13.28±2.14)%、(15.88±2.15)%、(15.34± 1.41)%、(12.23±1.69)%,氨0.01%組在短時(shí)間處理時(shí)也不錯(cuò),在15和30 min時(shí)受精卵分別達(dá)到了(13.82 ±2.65)%和(12.55±2.44)%。

圖2 氨海水處理對(duì)GVBD發(fā)生率的影響Fig.2 GVBD rate of AS treatment

圖3 氨海水處理對(duì)受精率的影響Fig.3 Fertilizing rate of AS treatment

2.3 5-HT對(duì)卵母細(xì)胞的促熟作用

櫛孔扇貝解剖出的卵母細(xì)胞在海水中浸泡一段時(shí)間也有部分生發(fā)泡破裂,不同濃度和時(shí)間的5-羥色胺處理后,生發(fā)泡破裂率沒(méi)有明顯的提高,與海水對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。但經(jīng)5-HT處理后,除0.004 mol/L組外,受精率都明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)圖5),差異極顯著(P<0.01)。0.002 mol/L處理組表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性,受精率隨著處理實(shí)踐的延長(zhǎng)而增高,處理45 min時(shí)受精率達(dá)到最大(24.74± 1.33)%;處理時(shí)間增加至60 min時(shí),受精率有所降低,但差異不顯著(P>0.05)。其它濃度處理組沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。相同時(shí)間處理下,表現(xiàn)出較強(qiáng)的濃度依賴性,除15 min外,其它處理時(shí)間下, 0.002 mol/L組受精率都明顯高于其它組,差異極顯著(P<0.01)。

圖4 5-HT對(duì)GVBD發(fā)生率的影響Fig.4 GVBD rate of 5-HT treatment

圖5 5-HT對(duì)受精率的影響Fig.5 Fertilizing rate of 5-HT treatment

2.4 氨海水與5-HT聯(lián)合促熟作用

使用氨海水最適濃度0.005%與不同濃度5-羥色胺混合處理時(shí),受精率極低,只有一部分生發(fā)泡破裂。如圖6所示,最高的相對(duì)GVBD發(fā)生率只有(8.48± 0.11)%,低于氨海水單獨(dú)作用,說(shuō)明氨水的作用受到5-羥色胺的抑制。

適當(dāng)提高氨海水濃度,與5-羥色胺混合處理, GVBD發(fā)生率達(dá)到100%。考慮到2種試劑間的相互干擾,特別添加了T組,即先后用最適條件的氨海水和5-羥色胺處理。

在混合處理中,氨0.010%與5-HT 0.001 mol/L混合取得最好效果,處理時(shí)間在15～30 min間受精率變化不明顯,為(24.09±1.13)%～(25.57±0.46)%之間,高于氨海水單獨(dú)處理。

圖6 聯(lián)合處理相互抑制下的相對(duì)GVBD發(fā)生率Fig.6 Comparatively GVBD rate of mix treatment

如圖7所示,除c組與d組濃度下45與60 min處理外,其它各組受精率都顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。時(shí)間依賴性上,T組在45 min受精率高于其它時(shí)間處理,差異顯著(P<0.05),其它濃度沒(méi)有時(shí)間依賴性;相同時(shí)間處理時(shí),在15 min、30 min時(shí)T組與200+1組差異不顯著(P>0.05),但高于其它濃度組(P< 0.01),在45 min時(shí),T組受精率高于其它濃度組(P< 0.01)。

圖7 聯(lián)合處理受精率Fig.7 Fertilizing rate of mix treatment

而用最適濃度的氨海水和5-羥色胺相繼處理的T組在處理45 min時(shí)表現(xiàn)出了整個(gè)實(shí)驗(yàn)最好的誘導(dǎo)效果,受精率達(dá)到(40.02±2.73)%,明顯高于混合處理和單獨(dú)處理(P<0.001)。

3 討論

3.1 解剖卵體外促熟的可行性

雙殼貝類精子入卵的時(shí)機(jī)有2種,1種是初級(jí)卵母細(xì)胞處于第一次減數(shù)分裂之前,如卵生型牡蠣、中國(guó)蛤蜊;另一種是初級(jí)卵母細(xì)胞生發(fā)泡已經(jīng)消失,初級(jí)卵母細(xì)胞處于第1次減數(shù)分裂中期[1],如扇貝、菲律賓蛤仔。

對(duì)于第1種類型的貝類,解剖獲得卵母細(xì)胞可以直接用于受精,但是,適當(dāng)?shù)捏w外促熟可以提高卵母細(xì)胞的同步性,提高受精率[1]。王昭萍等以太平洋牡蠣的剝離卵子為材料進(jìn)行體外促熟,采用海水浸泡及維生素處理等方法促進(jìn)成熟較差的卵子進(jìn)一步成熟,獲得了成功[2];任素蓮等利用海水、氨海水中浸泡使太平洋牡蠣的剝離卵生成泡破裂,促進(jìn)卵子的繼續(xù)發(fā)育,卵子在氨海水中的發(fā)育速度要快于在純海水中的發(fā)育速度[8];沈亦平等利用氨水和海水對(duì)解剖獲取的馬氏珠母貝卵子的促熟過(guò)程進(jìn)行了比較研究[3]。

對(duì)于第2種貝類,由于解剖獲得的卵母細(xì)胞處于前期,直接受精無(wú)法完成,所以多采用陰干等方法進(jìn)行催產(chǎn),體外促熟的研究比較少,氨海水體外促熟的方法在縊蟶、旗江珧[9]等貝類中有所應(yīng)用,但是效果一般; Gloria等利用組胺對(duì)紫扇貝卵子進(jìn)行體外促熟,避免了雌雄同體的自交[4]。

櫛孔扇貝也屬于第2種類型的貝類,目前還未見(jiàn)關(guān)于其解剖取卵及體外促熟的報(bào)道。本研究采用氨海水和5-羥色胺(5-HT)對(duì)櫛孔扇貝的解剖卵進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)氨海水能有效地促使卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂, GVBD發(fā)生率可高達(dá)100%;5-羥色胺對(duì)生發(fā)泡破裂無(wú)明顯作用,但可以顯著的提高生發(fā)泡已經(jīng)破裂的卵母細(xì)胞的受精率,氨海水與5-羥色胺的聯(lián)合處理使得櫛孔扇貝解剖卵受精率達(dá)40%,這為進(jìn)一步的試驗(yàn)及應(yīng)用提供了良好基礎(chǔ)。

3.2 生發(fā)泡破裂與卵母細(xì)胞成熟的關(guān)系

卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程對(duì)動(dòng)物卵子的受精以及以后的發(fā)育過(guò)程是至關(guān)重要的[10]。解剖獲得的櫛孔扇貝的卵母細(xì)胞處于前期I阻滯狀態(tài),經(jīng)過(guò)激活,會(huì)在第1次減數(shù)分裂的中期發(fā)生第2次阻滯,之后通過(guò)受精作用的激活完成整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程,并進(jìn)一步發(fā)育。

在已有的研究中,生發(fā)泡破裂(GVBD)通常被認(rèn)為是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[11],意味著卵母細(xì)胞啟動(dòng)了減數(shù)分裂。然而本研究發(fā)現(xiàn),生發(fā)泡破裂并不意味著卵母細(xì)胞的真正成熟。經(jīng)解剖獲得的櫛孔扇貝卵母細(xì)胞有時(shí)會(huì)有部分生發(fā)泡已經(jīng)破裂,但是這部分卵母細(xì)胞無(wú)法完成受精和分裂。同樣,用一定濃度的氨海水(0.005%～0.025%)處理櫛孔扇貝卵母細(xì)胞,可以顯著的促使生發(fā)泡破裂,GVBD發(fā)生率達(dá)到100%,但是受精率依然不高,表明生發(fā)泡破裂之后只有少量卵母細(xì)胞能進(jìn)一步完成成熟過(guò)程。

生發(fā)泡破裂可能只是是重新啟動(dòng)減數(shù)分裂的第一步,由生發(fā)泡破裂到第1次減數(shù)分裂中期這一過(guò)程卻不一定能實(shí)現(xiàn),依然需要激活。5-HT可以顯著的提高生發(fā)泡已經(jīng)破裂的卵母細(xì)胞的受精率,表明5-HT正是起到了這種激活作用。

由此可以看出,對(duì)櫛孔扇貝來(lái)說(shuō),生發(fā)泡破裂是卵母細(xì)胞成熟的必要條件,而非充分條件,生發(fā)泡破裂之后需要進(jìn)一步的激活才能使卵母細(xì)胞進(jìn)入到成熟過(guò)程。

3.3 氨海水和5-HT的互補(bǔ)性及作用機(jī)理

本研究表明,氨海水能有效地促使卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂,而5-羥色胺可以顯著的提高生發(fā)泡已經(jīng)破裂的卵母細(xì)胞的受精率,充分表明氨海水和5-HT對(duì)扇貝解剖卵的促熟作用具有一定的互補(bǔ)性。

Loosanoff提出在海水中加入氨海水溶液,可促使雙殼類(如Tapes Sedidecussata)卵母細(xì)胞生發(fā)泡的破裂,有利于卵的受精[12]。方永強(qiáng)進(jìn)一步肯定了氨海水是菲律賓蛤卵母細(xì)胞達(dá)到生理成熟的必要因子,并提出氨海水是通過(guò)激發(fā)核與細(xì)胞器的物質(zhì)和能量代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)激活作用的[13]。在本研究中,氨海水在一定濃度下可以顯著的促使櫛孔扇貝卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(見(jiàn)圖2),但是這種初步的作用并沒(méi)有得到可觀的受精率,最高只有15%左右(見(jiàn)圖3),可能是因?yàn)榘焙Ｋ拇偈熳饔帽容^初步,無(wú)法對(duì)卵母細(xì)胞的重要調(diào)控因子(如成熟促進(jìn)因子MPF、有絲分裂原激活的蛋白激酶MAPK、環(huán)磷酸腺苷cAMP等[14-16])起到關(guān)鍵的作用。

5-HT作為1種信號(hào)分子,可以與卵母細(xì)胞膜表面的G蛋白(GTP結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白)偶聯(lián)受體結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使,從而將胞外信號(hào)跨膜傳遞到胞內(nèi)影響細(xì)胞的行為。G蛋白偶聯(lián)受體所介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路主要包括cAMP信號(hào)通路和磷脂酰肌醇信號(hào)通路。目前的研究發(fā)現(xiàn),這2條通路都參與了雙殼貝類卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程[6,17-18]。王清等研究了cAMP信號(hào)通路在5-HT誘導(dǎo)硬殼蛤卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用[5]。本研究中,5-HT在所用的濃度范圍內(nèi)對(duì)櫛孔扇貝卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂沒(méi)有作用(見(jiàn)圖4),但是對(duì)已經(jīng)發(fā)生生發(fā)泡破裂的卵母細(xì)胞可以進(jìn)一步的激活,受精率雖然最高也只有25%左右(見(jiàn)圖5),但是相對(duì)于只有37%的GVBD發(fā)生率,激活效率很高。大多數(shù)情況下,解剖出的卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂率很低,所以單獨(dú)使用5-HT處理沒(méi)有明顯的促熟效果,這表明5-HT對(duì)櫛孔扇貝卵母細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控作用可能主要體現(xiàn)在生發(fā)泡破裂后到第一次減數(shù)分裂中期這個(gè)階段。

氨海水和5-HT的混合處理情況較復(fù)雜,當(dāng)使用氨海水濃度較低時(shí),5-HT顯著的抑制了氨海水的作用(見(jiàn)圖6),提高氨海水濃度的混合處理,受精率比單獨(dú)處理有所提高(25%),依然不夠理想。先用氨海水處理再用5-HT處理,排除了2種試劑的相互干擾,達(dá)到了較好效果,受精率最高達(dá)到40%以上,但這與生產(chǎn)應(yīng)用還有較大的距離。有關(guān)氨海水和5-HT對(duì)扇貝解剖卵的促熟條件優(yōu)化和作用機(jī)理尚有待于進(jìn)一步的研究。

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Abstract: To test the effect of ammonia seawater and 5-HT on the maturation of oocyte stripped from scallop,Chlamys f arreri(Jones et Preston),Oocytes were treated with ammonia seawater and 5-HT in vitro,and then fertilized artificially.Results showed that ammonia seawater can induce Germinal Vesicle Breakdown(GVBD)of scallop oocytes remarkably,but the fertilizing rate was low.5-HT can not induce GVBD of oocytes,but can induce the maturation of the oocytes already GVBD.Oocytes first induced by ammonia seawater then induced by 5-HT showed the best effects,and the fertilizing rate was(40.02± 2.73)%.

Key words: Chlamys f arrer(Jones et Preston);maturation improvement;ammonia seawater;5-HT

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Effect of Ammonia Seawater and 5-HT on Maturation of Oocyte Stripped from Scallop,Chlamys farreri(Jones et Preston)

DI Wei-Peng,WANG Zhao-Ping,YU Rui-Hai,ZHOU Shan-Shan,GU Ling-Ling,LI Ning
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S961.2+2

A

1672-5174(2011)04-046-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771622);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10A401)資助

2010-01-22;

2010-03-23

邸煒鵬(1984-),男,碩士生,主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail:diweipeng05110@163.com

E-mail:zpwang@ouc.edu.cn