煙曲霉再鑒定、標(biāo)準(zhǔn)化CSP分型及體外藥物敏感性

高露娟 余進(jìn) 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)是侵襲性曲霉病(IA)最主要的致病菌種，約占80%［1］。近年來，關(guān)于煙曲霉及相關(guān)菌種的種系發(fā)生研究更新了其分類和鑒定，增加了一些新菌種。其中一些新種，如A.lentulus和A.udagawae等，在菌落形態(tài)及光學(xué)顯微鏡下形態(tài)與經(jīng)典煙曲霉極為相似，不容易區(qū)分，正確的菌種鑒定依賴于分子生物學(xué)手段，如β-tubulin測(cè)序等［2］。國際專家提倡在臨床檢驗(yàn)中僅通過形態(tài)學(xué)和 (或)ITS測(cè)序鑒定時(shí)使用“煙曲霉復(fù)合體 (A.fumigatuscomplex)”這個(gè)概念［2］，并將其分為經(jīng)典煙曲霉和非經(jīng)典煙曲霉。研究表明A.lentulus和A.udagawae對(duì)一種或多種抗真菌藥物天然耐藥［3］，并且國際上已有相關(guān)菌種的致病性報(bào)道［4］。因此，正確菌種鑒定對(duì)指導(dǎo)臨床治療工作具有重要的意義。

我們對(duì)1991～2009年中國大陸地區(qū)1 457例曲霉病例進(jìn)行綜述發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)陽性的481例中僅258例進(jìn)行了菌種鑒定，而僅4例提供了分子生物學(xué)鑒定的依據(jù)，提示我國實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)水平受限，應(yīng)開展快速、簡便、準(zhǔn)確的鑒定體系，提高菌種鑒定水平［5］。

對(duì)經(jīng)典煙曲霉進(jìn)行種內(nèi)分型可了解不同菌株之間關(guān)系，用于曲霉病的流行病學(xué)研究。CSP分型是對(duì)煙曲霉細(xì)胞表面蛋白 (cell surface protein，CSP)編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，利用其編碼區(qū)域內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行分型［6］;具有良好的體內(nèi)、外穩(wěn)定性［6-7］，操作簡便經(jīng)濟(jì)，結(jié)果易解讀，無需特殊儀器或軟件。其分型能力適中，被認(rèn)為是煙曲霉種內(nèi)分型的最佳分型方法之一［8-9］。

由于口服唑類藥物廣泛應(yīng)用，煙曲霉獲得性唑類耐藥的報(bào)道也日漸增多。國際報(bào)道唑類藥物耐藥率為0% ～6%不等［10］，并有報(bào)道對(duì)新型唑類藥物伏立康唑和泊沙康唑的交叉耐藥現(xiàn)象［11］。此外，也有個(gè)案報(bào)道棘白菌素類藥物卡泊芬凈對(duì)煙曲霉的 MEC 值升高［12-14］。

本研究旨在對(duì)我中心保存的原鑒定為煙曲霉的臨床株重新進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及分子生物學(xué)綜合鑒定，了解煙曲霉復(fù)合體病原菌組成情況;應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化CSP分型對(duì)經(jīng)典煙曲霉進(jìn)行基因多態(tài)性分型，以明確菌株基因型分布，并與歐洲及澳大利亞研究結(jié)果進(jìn)行比較，為煙曲霉院內(nèi)流行性感染流行病學(xué)調(diào)查作基礎(chǔ);測(cè)定經(jīng)典煙曲霉對(duì)常用抗真菌藥物伊曲康唑(ITC)、兩性霉素B(AMB)、伏立康唑(VRC)及卡泊芬凈 (CAS)的敏感性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

162株煙曲霉復(fù)合體菌株均為臨床分離株，由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保存。菌株分離自全國各地的125名具有高危因素的患者，其中111株來自痰，12株來自支氣管肺泡灌洗液，11株來自鼻竇組織，6株來自角膜組織，4株來自皮膚，3株來自膿性分泌物 (腦、腹部、頭部)，3株來自胸水，2株來自膽汁，肺、頭皮、腦、眼球組織各1株，另有6株分離部位不詳。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

菌種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定:通過菌株在麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基 (MEA)和查氏瓊脂培養(yǎng)基 (CZA)，25℃培養(yǎng)下菌落生長速度、形態(tài)及鏡下分生孢子頭形態(tài)鑒定至煙色組。溫度試驗(yàn):根據(jù)菌株能否在48℃生長篩選非經(jīng)典煙曲霉。分子生物學(xué):對(duì)非經(jīng)典煙曲霉進(jìn)行 ITS及 β-tubulin［15］測(cè)序。

標(biāo)準(zhǔn)化 CSP分型 提取菌株 DNA，對(duì) CSP［9］基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，在其堿基序列中使用Microsoft office文件處理軟件Microsoft word的“查找與替換”功能尋找重復(fù)單位［16］，明確其連接順序，并利用DNAMAN軟件查找其重復(fù)區(qū)域上游第1、14、15及下游第1、2、3密碼子突變類型，根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化分型命名［9，16］進(jìn)行分型。統(tǒng)計(jì)我中心保存煙曲霉菌株分型情況，并與國外數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

體外藥敏試驗(yàn) 采用美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (CLSI)M38-A2微量液基稀釋法。最小抑菌濃度(MIC)定義為肉眼直接觀察到的無真菌生長的最低藥物濃度;最小有效濃度(MEC)定義為出現(xiàn)短而異常分支的菌絲時(shí)的最低藥物濃度。

由于CLSI的M38-A2方案尚未制定曲霉屬藥物敏感性的判讀折點(diǎn)，在分析中我們采用多中心煙曲霉體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析的“作用折點(diǎn)”，對(duì)AMB、ITC、VRC 和 CAS 而言，MIC/MEC≤1 μg/mL為敏感，MIC/MEC=2 μg/mL為中等敏感，MIC/MEC≥4 μg/mL 為耐藥［17］。

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定

162株臨床分離煙曲霉復(fù)合體菌株在MEA和CZA的菌落特征和顯微鏡特征均符合煙色組特征;所有菌株均能夠在48℃下生長，其中6株生長較弱;此6株經(jīng)ITS和β-tubulin測(cè)序，與CBS真菌數(shù)據(jù)庫及Genbank中多株經(jīng)典煙曲霉序列相比呈現(xiàn)100%一致性，證實(shí)為經(jīng)典煙曲霉。

2.2 經(jīng)典煙曲霉的CSP分型

經(jīng)典煙曲霉經(jīng)CSP引物擴(kuò)增后均產(chǎn)生單一條帶，～1 250 bp;中國162株經(jīng)典煙曲霉共分成16型，較多為t04A，t03和t01;其中5型為新增型別，包括3 株 t18B、1株 t21、8 株t22、1 株t23、1株 t24;我國菌株主要型別與澳大利亞、荷蘭菌株分布相似(見圖1)。

2.3 體外藥物敏感性狀況

不同抗真菌藥物MIC/MEC分布情況如圖2所示，ITC對(duì)83.9%(136株)煙曲霉的MIC值為1～2 μg/mL，VRC 對(duì) 72.2%(117 株)煙曲霉 MIC 值為0.5 μg/mL，AMB 對(duì) 71.6%(116 株)煙曲霉MIC 值為 1 μg/mL，CAS 對(duì) 67.2%(109 株)煙曲霉的 MEC 值為0.125～0.25 μg/mL。來自 4 名患者的13株菌對(duì)ITC耐藥，其中兩株分別對(duì)VRC、AMB也耐藥。CAS耐藥株1株。

圖1 中國、澳大利亞、荷蘭菌株分型情況 圖2 不同抗真菌藥物MIC/MEC分布情況Fig.1 CSP types of strains in China，Australia and Netherlands Fig.2 MIC/MEC values of different antifungal drugs

3 討 論

曲霉的準(zhǔn)確鑒定和分型是曲霉屬(Aspergillusspp.)系統(tǒng)發(fā)生研究的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)曲霉感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

目前，煙色組 (AspergillussectionFumigati)分為五個(gè)進(jìn)化支［18］。但不同分支菌落和光學(xué)顯微鏡下形態(tài)特征極為相似，臨床實(shí)驗(yàn)室僅通過菌落形態(tài)和顯微鏡下形態(tài)很容易鑒定錯(cuò)誤［19］，ITS測(cè)序也只能鑒定到組 (Section)的水平，正確的菌種鑒定依賴于分子生物學(xué)手段，如β-tubulin測(cè)序。雖然電子顯微鏡下分生孢子表面紋飾有所不同［2］，但電鏡下觀察孢子形態(tài)，多基因測(cè)序均消耗時(shí)間、經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較高，不適合在臨床實(shí)驗(yàn)室普遍開展。因此國際專家提倡在臨床檢驗(yàn)中僅通過形態(tài)學(xué)和 (或)ITS測(cè)序進(jìn)行鑒定時(shí)使用“煙曲霉復(fù)合體 (A.fumigatuscomplex)”這個(gè)概念［2］。

然而，研究表明一些新種存在天然耐藥:A.udagawae對(duì) AMB 和 VRC 敏感性下降［3-4，20］，N.pseudofisheri，A.fumigatiaffinis和A.viridinutans對(duì)AMB 和 所 有 唑 類 敏 感 性 均 下 降［4，19，21-22］。A.lentulus對(duì)AMB、所有唑類以及CAS敏感性均下降［3-4，21，23-25］。國際上已有相關(guān)天然耐藥菌種的致病報(bào)道，一項(xiàng)移植相關(guān)感染監(jiān)測(cè)研究表明，煙曲霉復(fù)合體引起的感染中經(jīng)典煙曲霉占93.9%，A.lentulus2. 7%，A.udagawae2. 0%，N.pseudofischeri0.8%，提示天然耐藥的菌種可能是臨床煙曲霉侵襲性感染抗真菌治療效果欠佳的原因之一［4］。

因此，在臨床工作中明確鑒定煙曲霉相關(guān)菌種，對(duì)于指導(dǎo)抗真菌藥物的選擇，改善患者預(yù)后是具有重要意義的。由于不同煙色組曲霉分支最高生長溫度不同，經(jīng)典煙曲霉，即第一進(jìn)化支，最高生長溫度為50℃，而其他分支為45℃或42℃;臨床實(shí)驗(yàn)室可以通過“菌落和顯微鏡下分生孢子頭結(jié)構(gòu)—煙曲霉復(fù)合體;溫度試驗(yàn)—不同分支;分子生物學(xué)測(cè)序—正確菌種”的順序來完成菌種的鑒定。煙曲霉復(fù)合體感染的病原菌多為經(jīng)典煙曲霉，大多數(shù)情況下只進(jìn)行到溫度試驗(yàn)即可，不至于給臨床實(shí)驗(yàn)室造成太大的負(fù)擔(dān)，適合于我國臨床實(shí)驗(yàn)室的條件。

本研究通過上述方案對(duì)我中心保存的162株臨床分離菌株進(jìn)行重新鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)所有分離株在MEA和CZA生長形態(tài)特征以及光學(xué)顯微鏡下產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)均較典型，所有菌株在48℃均能夠生長，但其中6株生長略緩慢，但分子生物學(xué)測(cè)序和比對(duì)證實(shí)為經(jīng)典煙曲霉。研究表明我中心煙曲霉復(fù)合體中均為經(jīng)典煙曲霉，未見新型菌種。

經(jīng)典煙曲霉是煙曲霉復(fù)合體引起感染最主要的致病菌，準(zhǔn)確和快速的分子分型對(duì)于流行病學(xué)研究，控制院內(nèi)感染爆發(fā)至關(guān)重要。CSP基因多態(tài)性在其編碼區(qū)內(nèi)重復(fù)單位不同的順序和數(shù)目變化，及重復(fù)區(qū)域兩側(cè)的點(diǎn)突變［26］。Klaassen［16］對(duì)荷蘭209株煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)不同重復(fù)單位，19個(gè)基因型，并提出標(biāo)準(zhǔn)化命名體系;同年，Kidd［9］等對(duì)澳大利亞菌株進(jìn)行分型，基因型增補(bǔ)至22個(gè)。本研究中對(duì)我國煙曲霉臨床株進(jìn)行分型，共分為16型，其中5個(gè)為新型，使CSP基因型增補(bǔ)至27個(gè)基因型，未發(fā)現(xiàn)新的重復(fù)單位。我國常見的基因型為 t04A，t03和t01，與澳大利亞和荷蘭菌株分布特征相似 (見圖1)，提示煙曲霉呈全球性廣泛分布;同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)5個(gè)新型，澳大利亞和荷蘭也發(fā)現(xiàn)了不同于其他地區(qū)的基因型，雖然數(shù)量少，不能除外樣本量的影響，但一定程度提示了不同地區(qū)可能存在不同的流行菌株。此外，我們的研究中發(fā)現(xiàn)同一名患者(如曲霉球)中可以分離出具有不同CSP基因型的菌株，提示在同一個(gè)患者身上可以存在多株煙曲霉［27］。本研究是國內(nèi)首次建立CSP分型方法對(duì)煙曲霉臨床分離株進(jìn)行分型，為下一步的臨床應(yīng)用提供了參考。但環(huán)境菌株的CSP分型仍有待補(bǔ)充。

目前，國際報(bào)道煙曲霉唑類藥物耐藥率為0% ～6%不等［10］。英國報(bào)道ITC耐藥率為5%，并且65%對(duì)VRC交叉耐藥，74%對(duì)泊沙康唑交叉耐藥［11］;荷蘭報(bào)道 ITC耐藥年發(fā)生率為1.7%～6%不等［28］。也有研究發(fā)現(xiàn)CAS的MEC值升高，CAS和AMB體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)治療效果不符［12，29］。

本研究發(fā)現(xiàn)來自4名患者的13株煙曲霉對(duì)ITC不敏感 (≥4 μg/mL)，其中9株來自1名煙曲霉球的患者，且該患者的分離株出現(xiàn)敏感-耐藥交替現(xiàn)象，提示臨床獲得性耐藥現(xiàn)象。我國經(jīng)典煙曲霉ITC耐藥率為3.2%，略低于國外報(bào)道數(shù)據(jù)，僅1株對(duì)VRC交叉耐藥。AMB、CAS僅個(gè)別耐藥。研究結(jié)果提示我們臨床中應(yīng)警惕獲得性耐藥的出現(xiàn)，及時(shí)進(jìn)行抗真菌藥物敏感試驗(yàn)有助于指導(dǎo)臨床治療。

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