七葉皂苷鈉對油酸制備急性肺損傷大鼠模型的療效觀察

王 彤 田 巍 倪 莉

急性肺損傷(ALI)是指在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等非心源性疾病時(shí),肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。各種原因引起 ALI的發(fā)病機(jī)制、病理變化和臨床過程較相似,共同病理基礎(chǔ)是:肺泡 -毛細(xì)血管急性損傷,通透性增強(qiáng),肺間質(zhì)淤血、滲出、水腫,肺泡透明膜形成和肺泡萎縮,而造成肺通氣與血比例失調(diào),分流量增加,機(jī)體呈低氧血癥、嚴(yán)重缺氧狀態(tài),肺部影像學(xué)為非均一性的滲出性病變[1,2]。ALI是臨床常見危重癥,病死率高,威脅重癥患者生命,影響存活患者生活質(zhì)量。多年來,已對 ALI進(jìn)行大量基礎(chǔ)和臨床研究,在發(fā)病機(jī)制和治療方面已取得一定進(jìn)展,但有關(guān) ALI治療方法還沒有突破,目前的干預(yù)手段和方法較有限,主要有原發(fā)病治療、呼吸支持治療及藥物治療[1,3,4]?？寡卓?jié)B出消腫脹藥、有類激素作用的七葉皂苷(簡稱七葉)對 ALI的治療情況尚不明了。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,觀察不同劑量及時(shí)間七葉對 ALI模型大鼠的作用,探討七葉對 ALI治療的合適劑量及遠(yuǎn)期療效,為臨床 ALI的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新藥物選擇。

材料與方法

1.材料:油酸,分析純,北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司,批號 20060416;甲強(qiáng)龍,輝瑞制藥有限公司,批號NF0567;七葉皂苷鈉注射液,山東綠葉制藥有限公司,批號 200704144。

2.實(shí)驗(yàn)過程:雄性 SD大鼠 96只,體重 200～250g(北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分 16組:空白對照 2h、6h、18h組(n=18),模型 2h、6h、18h組(n=18),七葉高劑量2h、6h組(n=12),七葉中劑量 2h、6h、18h組 (n=18)、七葉低劑量 2h、6h組(n=12),甲強(qiáng)龍 2h、6h、18h組(n=18),每小組6只大鼠。采用鼠尾靜脈緩慢注射油酸(0.1ml/kg)復(fù)制 ALI模型,模型復(fù)制 30min后對七葉各劑量組大鼠靜脈注射七葉6mg/kg,2mg/kg和 1mg/kg,對甲強(qiáng)龍組大鼠靜脈注射甲強(qiáng)龍5mg/kg[5]。除七葉高、低劑量組處理 2h、6h觀察外,其他組處理 2h、6h和 18h觀察。至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),用 1.25%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉大鼠,放血處死,留取血和肺組織標(biāo)本,低溫冷凍保存待測。

3.檢測指標(biāo):(1)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2):大鼠麻醉開腹,血?dú)忉槾┐谈怪鲃?dòng)脈取血 1ml,PHOX血?dú)夥治鰞x檢測 PaO2。(2)肺濕/干重比值(W/D):大鼠麻醉開胸,剪取右肺上葉相同部位,用濾紙吸去水分和血跡稱濕重,置電熱恒溫烤箱,烘烤 48h至干重恒定稱重,計(jì)算肺濕/干重比值(W/D)。(3)血漿及肺組織 SOD、MDA:處死大鼠,取動(dòng)脈血、離心,取上清血漿 -70℃凍存?zhèn)錅y;剪取適量肺組織稱重、勻漿、低溫離心,取上清勻漿液凍存?zhèn)錅y。按 SOD、MDA試劑盒說明書,檢測血漿、肺勻漿 SOD、MDA。

結(jié) 果

1.2h及 6h動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、肺濕干 /重比值(W/D)變化:(1)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2):與空白對照組比,2h及 6h,模型組 PaO2明顯降低(P＜0.001)。與模型組比,2h及 6h,七葉各劑量組 PaO2明顯升高(P＜0.05和 P＜0.001);6h時(shí)甲強(qiáng)龍組PaO2明顯升高(P＜0.05)。與甲強(qiáng)龍組比,2h時(shí),七葉中、低劑量組 PaO2明顯升高(P＜0.01);6h時(shí),七葉各劑量組 PaO2明顯升高(P＜0.01和 P＜0.001)。與七葉高劑量組比,2h時(shí),七葉中劑量組 PaO2明顯升高(P＜0.05)。(2)肺濕 /干重比(W/D):與空白對照組比,2h及 6h,模型組 W/D明顯升高 (P＜0.01)。與模型組比,2h及 6h,七葉各劑量組及甲強(qiáng)龍組 W/D明顯降低(P＜0.05和 P＜0.01)。與甲強(qiáng)龍組比,七葉各劑量組 W/D無明顯變化(P均 ＞0.05)。七葉各劑量組間 W/D無明顯變化(P均 ＞0.05)(表1)。

2.2h及 6h血漿和肺組織 SOD變化:與空白對照組比,2h及 6h,模型組血漿及肺組織 SOD明顯降低(P＜0.05或 P＜0.001)。與模型組比,2h時(shí),七葉高、中劑量組血漿 SOD明顯升高(P＜0.05和 P＜0.01);6h時(shí),七葉各劑量組及甲強(qiáng)龍組血漿 SOD明顯升高(P＜0.05和 P＜0.01);2h時(shí),七葉高劑量組肺勻漿 SOD明顯升高(P＜0.05)。與甲強(qiáng)龍組比,2h時(shí),七葉中劑量組血漿 SOD明顯升高(P＜0.05);6h時(shí),七葉高、中劑量組血漿 SOD明顯升高(P＜0.05)。與七葉中劑量組比,2h時(shí),低劑量組血漿SOD明顯降低(P＜0.05)(表2)。

表1 2h、6h時(shí)各組 PaO2、W/D變化比較(±+s)

表1 2h、6h時(shí)各組 PaO2、W/D變化比較(±+s)

與空白對照組比較,aP＜0.01,aa P＜0.001;與模型組比較,b P＜0.05,bbP＜0.01,bbb P＜0.001;與甲強(qiáng)龍組比較,c P＜0.01,cc P＜0.001;與七葉高劑量組比較,d P＜0.05

組別PaO2(kPa)W/D 2h 6h 2h 6h空白對照組 14.98±1.23 14.74±1.01 4.98±0.10 4.81±0.19模型組 8.42±0.32aa 8.56±0.51aa 5.91±0.15a 5.99±0.10a七葉高劑量組 9.87±0.54b 11.92±0.44bbbc 5.00±0.11b 4.77±0.16b七葉中劑量組 11.63±0.47bbbcd 12.50±0.31bbbcc 5.03±0.14b 4.64±0.20bb七葉低劑量組 11.09±0.22bbbc 12.02±0.51bbbc 5.13±0.27b 4.89±0.12b甲強(qiáng)龍組 9.10±1.07 9.98±0.20b 5.02±0.13b 4.84±0.13b

表2 2h、6h時(shí)各組血漿和肺勻漿 SOD變化比較[(U?mg)/Pro,±+s]

表2 2h、6h時(shí)各組血漿和肺勻漿 SOD變化比較[(U?mg)/Pro,±+s]

與空白對照組比較,a P＜0.05,aaP＜0.001;與模型組比較,b P＜0.05,bbP＜0.01;與甲強(qiáng)龍組比較,c P＜0.05;與七葉中劑量組比較,d P＜0.05

組別 血漿SOD肺勻漿 SOD 2h 6h 2h 6h空白對照組 124.36±4.26 125.21±5.01 132.53±12.11 133.42±13.01模型組 90.01±5.98aa 89.99±6.62aa 98.41±17.92a 100.56±8.69a七葉高劑量組 105.74±6.25b 112.01±7.44bbc 122.79±13.12b 116.57±16.04七葉中劑量組 111.71±7.02bbc 113.12±10.01bbc 114.93±14.48 114.04±14.97七葉低劑量組 99.01±3.75d 106.42±9.64b 108.54±12.11 112.53±15.42甲強(qiáng)龍組 100.56±7.84 110.23±8.43b 107.89±14.52 115.22±18.55

3.2h及 6h血漿和肺組織 MDA變化:與空白對照組比,2h及 6h,模型組血漿及肺組織 MDA明顯升高(P＜0.01或 P＜0.001)。與模型組比,2h及 6h,七葉高劑量組血漿 MDA明顯降低(P＜0.05);2h時(shí),甲強(qiáng)龍組血漿 MDA明顯降低(P＜0.05);2h及6h,七葉各劑量組及甲強(qiáng)龍組肺組織 MDA明顯降低(P＜0.05或 P＜0.01)。與甲強(qiáng)龍組比,七葉各劑量組 MDA無明顯變化(P＞0.05);七葉各劑量組間MDA無明顯變化(P＞0.05)(表3)。

表3 2h、6h時(shí)各組血漿和肺勻漿 MDA變化比較[(μmol?g)/Pro,±+s]

表3 2h、6h時(shí)各組血漿和肺勻漿 MDA變化比較[(μmol?g)/Pro,±+s]

與空白對照組比較,aP＜0.01,aa P＜0.001;與模型組比較,b P＜0.05,bbP＜0.01

組別 血漿MDA肺勻漿 MDA 2h 6h 2h 6h空白對照組 3.56±0.33 3.69±0.42 3.78±0.43 3.84±0.39模型組 5.81±0.67a 5.96±0.91a 6.17±0.65aa 6.39±0.61aa七葉高劑量組 4.43±0.71b 4.50±0.54b 4.73±0.48bb 4.52±0.42bb七葉中劑量組 4.82±0.97 4.87±1.15 4.57±1.56b 4.51±1.20b七葉低劑量組 5.11±0.83 4.89±0.67 4.82±1.23b 4.56±0.85b甲強(qiáng)龍組 4.40±0.72b 4.82±0.74 4.93±0.81b 4.59±0.73b

4.18h時(shí) PaO2、W/D、血漿及肺勻漿 SOD、MDA變化:(1)18h時(shí) PaO2、W/D變化:與空白對照組比,18h,模型組 PaO2明顯降低,W/D明顯升高(P＜0.05和 P＜0.01);與模型組比,七葉中劑量組和甲強(qiáng)龍組PaO2明顯升高,W/D明顯降低(P＜0.05);與甲強(qiáng)龍組比,七葉組 PaO2、W/D無明顯變化(P＞0.05)(表4)。(2)18h時(shí)血漿及肺勻漿 SOD、MDA變化:與空白對照組比,18h,模型組血漿及肺勻漿 SOD明顯降低,MDA明顯升高(P＜0.05和 P＜0.01);與模型組比,七葉中劑量組和甲強(qiáng)龍組 SOD明顯升高,W/D明顯降低(P＜0.05);與甲強(qiáng)龍組比,七葉皂苷鈉組SOD、MDA無明顯變化(P＞0.05)(表5)。

表4 18h時(shí) PaO2、W/D變化結(jié)果比較(±+s)

表4 18h時(shí) PaO2、W/D變化結(jié)果比較(±+s)

與空白對照組比較,a P＜0.05,aa P＜0.01;與模型組比較,b P＜0.05

組別 /指標(biāo) PaO2(kPa) W/D空白對照組 14.56±0.58 3.78±0.19模型組 10.12±0.42aa 5.07±0.13a七葉中劑量組 13.28±0.71b 4.09±0.08b甲強(qiáng)龍組 13.08±0.66b 4.15±0.11b

表5 18h時(shí)血漿及肺勻漿 SOD、MDA變化結(jié)果比較(±+s)

表5 18h時(shí)血漿及肺勻漿 SOD、MDA變化結(jié)果比較(±+s)

與空白對照組比較,aP＜0.05,aa P＜0.01;與模型組比較,bP＜0.05

組別 血漿SOD[(U?mg)/Pro]肺勻漿SOD[(U?mg)/Pro]血漿MDA[(μmol? g)/Pro]肺勻漿MDA[(μmol? g)/Pro]空白對照組 123.72±6.78 134.35±11.21 3.78±0.46 3.69±0.54模型組 95.52±5.46a 104.37±10.34aa 5.53±0.46a 5.99±0.42a七葉中劑量組 116.34±12.13b 115.86±20.23b 4.17±0.67b 4.43±0.68b甲強(qiáng)龍組 118.71±12.02b 118.06±11.45b 4.23±0.49b 4.51±0.45b

討 論

七葉皂苷為七葉樹果實(shí)娑羅子的提取物,其能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生 ACTH和 COR,促進(jìn)血管壁分泌 PGF2α,而具類糖皮質(zhì)激素抗炎、抗?jié)B出、消腫脹作用[6];其能穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞和清除氧自由基,提高靜脈張力,促進(jìn)淋巴回流,改善微循環(huán)等,而用于治療多種臨床疾病[7]。有報(bào)道,七葉對于肺性腦病患者的臨床癥狀、血?dú)夥治龅扔休^好改善作用[8];亦有研究表明,七葉能有效預(yù)防嚴(yán)重急性放射性肺損傷,而無激素類不良反應(yīng),且能提高患者生活質(zhì)量[9]。但七葉對 ALI的作用及機(jī)制目前還不清楚,故開展預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察其對 ALI模型大鼠的作用及可能途徑。本研究旨在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,觀察不同劑量七葉對 ALI模型大鼠的干預(yù),通過比較不同劑量的效果及機(jī)制,篩選合適劑量進(jìn)行長期療效觀察,探討其對 ALI模型的遠(yuǎn)期療效,從而為使用七葉治療 ALI提供劑量、時(shí)間參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果表明:與空白對照組比,2h及 6h,模型組 PaO2明顯降低,W/D明顯升高。與模型組比,2h及 6h,七葉各劑量組 PaO2明顯升高、W/D明顯降低;6h時(shí)甲強(qiáng)龍組 PaO2明顯升高;2h及 6h,甲強(qiáng)龍組 W/D明顯降低。結(jié)果說明不同劑量七葉對油酸制備 ALI大鼠模型均有改善作用。同時(shí),與甲強(qiáng)龍組比,2h時(shí),七葉中、低劑量組 PaO2明顯升高;6h時(shí),七葉各劑量組 PaO2明顯升高。2h及 6h,七葉各劑量組 W/D均無明顯變化。說明七葉對油酸制備 ALI模型 PaO2的改善作用優(yōu)于甲強(qiáng)龍。

進(jìn)一步對七葉各劑量組間比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與七葉高劑量組相比較,2h時(shí),七葉中劑量組 PaO2明顯升高,其他組及時(shí)間點(diǎn) PaO2無明顯變化。2h及6h,七葉各劑量組間 W/D無明顯變化。結(jié)果提示,本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),七葉無明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。因PaO2是臨床反映 ALI改善的關(guān)鍵指標(biāo),七葉中劑量組 PaO2改善作用更明顯,而前期預(yù)實(shí)驗(yàn)更大劑量使用七葉可使大鼠出現(xiàn)血尿(預(yù)實(shí)驗(yàn)七葉為 12mg/kg和 6mg/kg,12mg/kg七葉使大鼠尿血,6mg/kg沒有出現(xiàn),考慮七葉毒性不良反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)將 6mg/kg設(shè)為高劑量),故在七葉對 ALI干預(yù)作用相當(dāng)時(shí),從用藥安全性考慮,使用小劑量較好。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)后期為了更好觀察七葉對 ALI治療的長期效應(yīng),因在前期實(shí)驗(yàn)中有觀察 2mg/kg的干預(yù)情況,為了再次重復(fù)驗(yàn)證,我們選擇中劑量 2mg/kg繼續(xù)觀察。結(jié)果為:與空白對照組比,18h,模型組 PaO2明顯降低,W/D明顯升高;與模型組比,七葉中劑量組和甲強(qiáng)龍組 PaO2明顯升高,W/D明顯降低;與甲強(qiáng)龍組比,七葉組 PaO2、W/D無明顯變化。結(jié)果說明,18h時(shí),七葉和甲強(qiáng)龍均對油酸制備ALI大鼠模型PaO2、W/D有調(diào)節(jié)作用,且兩者療效相當(dāng)。

在觀察不同劑量七葉對油酸制備 ALI模型近期作用及遠(yuǎn)期療效的同時(shí),我們對其抗炎、抗?jié)B出機(jī)制進(jìn)行相關(guān)探討。研究認(rèn)為,肺部炎癥細(xì)胞聚集并釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致肺毛細(xì)血管膜通透性增高是 ALI的病理學(xué)標(biāo)志,其中氧自由基為主要炎癥介質(zhì)是造成肺血管損傷的重要因素[10]。ALI時(shí)來自中性粒細(xì)胞的相關(guān)氧自由基清除劑可減輕損傷[11]。SOD能有效清除代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基,MDA是自由基使細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。SOD和 MDA常作為一對指標(biāo)共同反映自由基代謝及組織受自由基攻擊的嚴(yán)重程度,發(fā)病早期患者血SOD下降、MDA升高,認(rèn)為氧化應(yīng)激在 ALI發(fā)生發(fā)展中占重要地位[12,13]。結(jié)果為:與空白對照組比,2h及6h,模型組血漿及肺組織 SOD明顯降低,MDA明顯升高。與模型組比,2h時(shí),七葉高、中劑量組血漿SOD明顯升高;6h時(shí),七葉各劑量組及甲強(qiáng)龍組血漿SOD明顯升高;2h時(shí),七葉高劑量組肺勻漿 SOD明顯升高。2h及 6h,七葉高劑量組血漿 MDA明顯降低;2h時(shí),甲強(qiáng)龍組血漿 MDA明顯降低;2h及 6h,七葉各劑量組及甲強(qiáng)龍組肺組織 MDA明顯降低。提示七葉可能通過影響 ALI大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮抗炎、抗?jié)B出作用。

綜上所述,本研究通過觀察不同劑量七葉對油酸制備 ALI模型大鼠的干預(yù),證實(shí)七葉對 ALI模型的治療作用;對七葉不同劑量的結(jié)果分析,可知其較小劑量安全有效;對合適劑量七葉進(jìn)行長期療效觀察,表明其對 ALI模型有遠(yuǎn)期療效;最后,從氧化應(yīng)激角度,對七葉抗炎、抗?jié)B出作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,為臨床使用七葉治療 ALI提供劑量、時(shí)間和機(jī)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),本研究還存在不足:前期預(yù)實(shí)驗(yàn) 12mg/kg七葉使大鼠尿血即停止實(shí)驗(yàn)而未觀察其他病理損傷,本實(shí)驗(yàn)減小劑量觀察七葉療效時(shí),也未對其可能損傷進(jìn)行病理安全性觀察,提示今后研究應(yīng)對小劑量七葉的療效和安全性進(jìn)行全面考察;臨床 ALI的病因和發(fā)病機(jī)制有多種,其對應(yīng)的藥物作用途徑和機(jī)制也很復(fù)雜,氧化應(yīng)激反應(yīng)只是其中的一種,其他可能途徑有待在后續(xù)研究中補(bǔ)充和完善。

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