桑生除痹合劑對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎組織形態(tài)學(xué)和血液流變學(xué)的影響

王 平，盧啟貴，徐 展，孫克民，黃東紅，裴代平

（深圳平樂骨傷科醫(yī)院關(guān)節(jié)病科，廣東 深圳 518010）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人常見、多發(fā)和比較難治的一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病。隨著年齡的增長和社會人口老齡化進(jìn)程加劇，OA的發(fā)病率明顯增高，嚴(yán)重危害著中老年人的健康。桑生除痹合劑是國家級名老中醫(yī)郭春園教授的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)深圳平樂骨傷科醫(yī)院制劑車間按現(xiàn)代工藝生產(chǎn)用于治療骨性關(guān)節(jié)炎，經(jīng)多年臨床應(yīng)用收到較好的效果。本實(shí)驗(yàn)旨在通過組織病理切片技術(shù)、血液流變學(xué)分析，觀察桑生除痹合劑對家兔膝關(guān)節(jié)炎的軟骨、滑膜組織的病理改變和血液流變學(xué)的影響，研究桑生除痹合劑防治0A的作用機(jī)制?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康6月齡新西蘭大白兔36只，體質(zhì)量（2 000±100）g，雌雄各半，由上海醫(yī)用動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證書：SCXK(滬)2002-0011。采用一兔一籠喂養(yǎng)方式，室溫20～25℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥物 桑生除痹合劑由深圳平樂骨傷科醫(yī)院制劑室提供，制劑批準(zhǔn)文號：粵藥制字04000136。藥物：桑寄生、續(xù)斷、山藥、枸杞子、五加皮、骨碎補(bǔ)、防風(fēng)、羌活、防己、秦艽、威靈仙、白術(shù)、茯苓、澤瀉、當(dāng)歸、川芎、白芍、生地黃、川牛膝、牡丹皮、地龍、木瓜、甘草。壯骨關(guān)節(jié)丸主要由狗脊、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、獨(dú)活、木香、雞血藤、川斷、熟地黃等藥物組成（南方制藥廠生產(chǎn)，批號：N20050815）。

1.1.3 試劑 蘇木素染色液；伊紅染色液；麗春紅酸性品紅液；苯胺藍(lán)液；Weigert氏鐵蘇木精；MAIXINBIO RapId CalImmunoTM快速脫鈣液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供）。

1.1.4 儀器 北京世帝R80-A全血黏度儀；德國MicroTec CUT 4060切片機(jī)；顯微鏡日產(chǎn)Olympus vanox型。

1.2 方法

1.2.1 動物分組方法 隨機(jī)分為6組，正常組：正常喂養(yǎng)；模型組：造模后不用藥；余下4組，壯骨關(guān)節(jié)丸組：造模后灌服壯骨關(guān)節(jié)丸；桑生除痹合劑低、中、高劑量組（以下簡稱低、中、高劑量組）：造模后灌服低、中、高劑量桑生除痹合劑。

1.2.2 模型制作 同等條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取模型組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、桑生除痹合劑低、中、高組，均按照Hulth法行改良手術(shù)造模[1]，各組動物于手術(shù)前禁食水10 h，以兔左膝為手術(shù)對象，無菌條件下實(shí)行手術(shù)。術(shù)前用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg的劑量行耳緣靜脈麻醉，并配合鹽酸利多卡因注射液局部肌注麻醉以松弛肌肉。麻醉后，將兔仰臥捆綁于兔解剖臺上，左膝關(guān)節(jié)局部脫毛、備皮、消毒、鋪巾，取髕內(nèi)側(cè)縱切口，長約2 cm，依次切開皮膚，淺、深筋膜，在直視下分離、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，打開膝關(guān)節(jié)腔，完整摘除內(nèi)側(cè)半月板并切斷前交叉韌帶，術(shù)中盡量避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面，抽屜試驗(yàn)、內(nèi)側(cè)應(yīng)力實(shí)驗(yàn)證實(shí)各韌帶完全切斷后，沖洗，徹底止血，逐層縫合，無菌敷料包扎，不固定傷肢。

1.2.3 給藥方法 術(shù)后連續(xù)3 d青霉素肌注20萬單位，每日2次，以預(yù)防感染。手術(shù)1周后，每天強(qiáng)迫動物活動30 min，分2次驅(qū)趕。給藥劑量均按50 kg成年人體表面積換算，每天灌胃量為10 mL。高劑量組含生藥量為5.06 g/mL；中劑量組含生藥量為2.53 g/mL；低劑量組含生藥量為1.27 g/mL。壯骨關(guān)節(jié)丸組每天灌胃量為10 mL，含生藥量為0.12 g/mL。將藥物碾磨，用生理鹽水配制成濃度為0.12 g/mL混懸溶液。藥物置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 標(biāo)本采集 用靜脈空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動物，立即打開兔患膝關(guān)節(jié)腔，用手術(shù)解剖刀緊貼關(guān)節(jié)囊內(nèi)壁，小心剝?nèi)∠リP(guān)節(jié)前正中的部分關(guān)節(jié)滑膜，置入EP管內(nèi)，10%福爾馬林固定。用骨剪取股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨，修成5 mm×5 mm×3 mm的全軟骨層標(biāo)本，10%福爾馬林固定，MAIXIN-BIO Rapid Cal Immuno TM快速脫鈣液脫鈣，梯度乙醇常規(guī)脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋。連續(xù)4μm厚切片，鋪片，烘干，滑膜標(biāo)本作HE染色，軟骨標(biāo)本1份作HE染色，1份作Masson三色染色。各組動物于取材前禁食10 h，將兔仰臥位固定于兔臺上，備皮，用注射器滴入少許2%肝素生理鹽水，使之充滿骨穿針腔。用一次性注射器自耳中動脈抽取4 mL血，注入抗凝試管，搖勻，室溫下保存，3 h內(nèi)送檢。

1.2.5 觀察指標(biāo) （1）關(guān)節(jié)滑膜及軟骨病理組織學(xué)觀察：光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織形態(tài)學(xué)改變。（2）血液流變學(xué)測定：全自動血液流變儀檢測血流變學(xué)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 桑生除痹合劑對兔膝關(guān)節(jié)軟骨、滑膜的組織形態(tài)學(xué)的影響

圖1（1-3）（1）均為正常組關(guān)節(jié)軟骨面表面平滑，無鈣化，表層細(xì)胞小而扁平，少見細(xì)胞分裂，4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨細(xì)胞排列成柱狀，未見軟骨細(xì)胞簇，潮線完整；（2）Masson染色軟骨膠原藍(lán)綠色，鈣化軟骨及骨的膠原呈紅色；（3）滑膜細(xì)胞呈單層排列，間質(zhì)無水腫，無炎性細(xì)胞浸潤聚積，有的可見少量毛細(xì)血管增生；圖1（4-6）（4）均為模型組關(guān)節(jié)軟骨表層菲薄，粗糙，部分因受蝕損，表面剝脫、纖維化，形成缺損區(qū)，可見多個(gè)空隙窩，部分區(qū)域成絨毛狀，表層裂隙多且深，向下能深達(dá)輻射層，裂隙中可見稀疏結(jié)締組織及松散的網(wǎng)狀連接，裂隙周圍可見脫水固縮壞死的軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，各層結(jié)構(gòu)不易分辨，潮線多不完整或完全消失，軟骨細(xì)胞增生顯著，大部分是散在增生和巢狀增生，部分軟骨細(xì)胞核固縮壞死，偏于一側(cè)，鈣化層可出現(xiàn)軟骨細(xì)胞簇積現(xiàn)象；（5）Masson染色見軟骨藍(lán)綠色染色丟失嚴(yán)重，潮線上普遍有向上的火焰狀突起的紅染物，幾乎達(dá)到軟骨表層；（6）滑膜明顯增厚，纖維組織大量增生，滑膜可見大量炎性細(xì)胞浸潤、聚積，滑膜下毛細(xì)血管增生，間質(zhì)水腫；圖 1（7-9）（7）均為壯骨關(guān)節(jié)丸組軟骨面粗糙，表面有少許表淺裂隙，但裂隙表淺，軟骨細(xì)胞排列較整齊，呈柱狀，表淺層軟骨細(xì)胞大量消失，放射層軟骨細(xì)胞萎縮，鈣化層軟骨細(xì)胞輕度成簇，但細(xì)胞增生明顯少于模型組，潮線較整齊，部分軟骨剝脫，出現(xiàn)少許空隙窩；（8）Masson染色見全層未鈣化軟骨藍(lán)綠染色達(dá)2/3以上，紅色火焰狀升起相對低而少；（9）滑膜細(xì)胞、纖維組織輕度增生，毛細(xì)血管增生，間質(zhì)有水腫，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤；圖 1（10-12）（10）均為中劑量組軟骨表面尚光滑，軟骨細(xì)胞排列整齊，呈柱狀，未見明顯軟骨剝脫，無明顯空隙窩，細(xì)胞減少現(xiàn)象不明顯，軟骨細(xì)胞核萎縮，細(xì)胞增生散在，簇狀增生少見，潮線完整，未見有軟骨蝕損；（11）Masson染色全層沒鈣化軟骨藍(lán)綠染色保存較完整；（12）滑膜未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，滑膜上皮無增生及間質(zhì)水腫；圖1（13-15）均為低劑量組關(guān)節(jié)軟骨變化基本同模型組；圖1（16-18）均為高劑量組介于模型組、壯骨關(guān)節(jié)丸組之間，較壯骨關(guān)節(jié)丸組退變重。結(jié)果見圖1。

圖1 桑生除痹合劑對兔膝關(guān)節(jié)軟骨、滑膜的組織形態(tài)學(xué)影響光鏡圖（×200）

2.2 桑生除痹合劑對兔血液流變學(xué)的影響

全血黏度低切變模型組和正常組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、中劑量組、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，正常組、壯骨關(guān)節(jié)丸組和各治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；中切變模型組和正常組、中劑量、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；模型組和壯骨關(guān)節(jié)丸組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，正常組、壯骨關(guān)節(jié)丸組和各治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；高切變模型組和正常組、中劑量組、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，和壯骨關(guān)節(jié)丸組、低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低劑量組和中劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。全血還原黏度低切變模型組和壯骨關(guān)節(jié)丸組、中劑量組、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；中切變模型組和正常組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組和壯骨關(guān)節(jié)丸組及各治療組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，正常組、壯骨關(guān)節(jié)丸組和各治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；高切變模型組和壯骨關(guān)節(jié)丸組、低劑量組、中劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血漿黏度壯骨關(guān)節(jié)丸組和低劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低劑量組和中、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。紅細(xì)胞聚集指數(shù)模型組和正常組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、高劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 桑生除痹合劑對兔膝OA模型血液流變學(xué)的影響 s，n=6）

表1 桑生除痹合劑對兔膝OA模型血液流變學(xué)的影響 s，n=6）

注：與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中劑量組比較 &P＜0.05；與高劑量組比較 #P＜0.05；與低劑量組比較$P＜0.05。

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3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎 (OA)實(shí)驗(yàn)動物模型的建立是研究OA病理機(jī)制及防治的必要手段，經(jīng)大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，誘發(fā)模型中，Hulth造模方法成功率較高，造模手術(shù)后5 d即有軟骨退變出現(xiàn)，術(shù)后6周即可獲穩(wěn)定OA。本實(shí)驗(yàn)采用改良Hulth造模方法，唯一區(qū)別于Hulth的方面，只是切斷前交叉韌帶，而不是將前后交叉韌帶都切斷。這樣做使實(shí)驗(yàn)動物膝關(guān)節(jié)尚存一定的穩(wěn)定性，不致于加重對膝關(guān)節(jié)的破壞。本實(shí)驗(yàn)造模方法較Hulth造模法操作簡單、創(chuàng)傷小，通過手術(shù)造成的膝關(guān)節(jié)長期慢性應(yīng)力失常，最終發(fā)展為膝0A。此模型導(dǎo)致軟骨退變基本符合臨床上的發(fā)生機(jī)理。同時(shí)為了縮短動物模型制作期，根據(jù)臨床上超疲勞活動容易提前出現(xiàn)OA的發(fā)病特點(diǎn)，對模兔采用單籠喂養(yǎng)，使之有一定活動范圍，并每日驅(qū)趕動物以增加術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)的磨損及負(fù)重機(jī)會。通過觀察實(shí)驗(yàn)兔的一般情況，發(fā)現(xiàn)模型組家兔均有不同程度的左膝關(guān)節(jié)跋行、關(guān)節(jié)活動范圍受限及關(guān)節(jié)畸形等表現(xiàn)，與OA病人的臨床癥狀與體征相似；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M組織形態(tài)學(xué)及檢測指標(biāo)來看，也證實(shí)術(shù)后其軟骨退變己非常明顯，與臨床骨關(guān)節(jié)炎的病理改變相似，從而證實(shí)了改良Nulth造模在本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的可靠性及可行性。

OA在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中歸屬痹病之骨痹范疇。近年來，中藥在防治OA的實(shí)驗(yàn)研究方面取得了很大進(jìn)展，葉俊星等[2]用骨痛膠囊治療兔OA,證明骨痛膠囊內(nèi)服能有效的降低兔膝關(guān)節(jié)骨內(nèi)高壓，明顯改善骨髓內(nèi)血液流變學(xué)狀態(tài)。童敏等[3]運(yùn)用骨康合劑對兔膝OA治療，結(jié)果顯示骨康合劑能通過改善骨關(guān)節(jié)炎血流動力學(xué)和血液流變學(xué)狀態(tài)，防止退行性改變。陳飛雁等[4]在觀察威靈仙注射液對骨關(guān)節(jié)炎模型動物關(guān)節(jié)軟骨膠原表型的作用中發(fā)現(xiàn)，威靈仙組能夠延緩異常膠原表達(dá)的出現(xiàn)，有效緩解基質(zhì)膠原降解破壞的程度。胡敏等[5]研究益氣通絡(luò)方對兔軟骨細(xì)胞活性及代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)益氣通絡(luò)方通過阻斷分解代謝細(xì)胞因子,防止膠原纖維轉(zhuǎn)型而促進(jìn)細(xì)胞增殖。師彬等[6]證實(shí)活骨丸能夠改善股骨頭血液流變學(xué)特性，改善微循環(huán)，扭轉(zhuǎn)股骨頭缺血狀態(tài)，促進(jìn)骨髓修復(fù)再生，抑制股骨頭壞死的發(fā)生與發(fā)展。桑生除痹合劑采用深圳市平樂骨傷科醫(yī)院國家級名老中醫(yī)郭春園教授的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)本院制劑車間按現(xiàn)代工藝生產(chǎn)，用于治療骨性關(guān)節(jié)炎方，經(jīng)多年使用收到較好的效果。功能補(bǔ)腎健骨、化痹止痛，主要用于治療骨性關(guān)節(jié)炎的筋骨痿軟、腫脹疼痛等癥。從關(guān)節(jié)軟骨的退變來看，模型組關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重，壯骨關(guān)節(jié)丸組和治療組均顯示存在軟骨增生、龜裂、局部缺損，但經(jīng)藥物治療，壯骨關(guān)節(jié)丸組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組、實(shí)驗(yàn)III組退變程度明顯小于模型組，表明桑生除痹合劑可以減少或阻斷軟骨的丟失，修復(fù)損害的軟骨。現(xiàn)代研究認(rèn)為滑膜炎癥在OA的發(fā)病中起著重要的作用，吳紅娟等[7,8]的實(shí)驗(yàn)提示，藥物對OA的療效與其能降低關(guān)節(jié)滑液NO水平有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中組織學(xué)觀察見模型組滑膜充血水腫甚至增生。關(guān)節(jié)囊肥厚、增生、粘連，滑膜炎性表現(xiàn)嚴(yán)重。而治療組的炎性細(xì)胞浸潤明顯低于模型組，證實(shí)桑生除痹合劑可以作用于軟骨及滑膜細(xì)胞，抑制炎性介質(zhì)的釋放，減輕滑膜炎癥，增加軟骨細(xì)胞的代償能力，達(dá)到防治OA的效果。近年來，許多學(xué)者證實(shí)，中藥可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制軟骨細(xì)胞凋亡[9-11]。在實(shí)驗(yàn)中觀察到中劑量組、高劑量組的家兔關(guān)節(jié)軟骨面雖也有粗糙，但裂隙表淺，細(xì)胞增生散在，簇狀增生少見，且未見軟骨蝕損，明顯優(yōu)于模型組。我們認(rèn)為桑生除痹合劑可以增加軟骨細(xì)胞的代償能力，調(diào)整軟骨細(xì)胞的代謝向正常軌道轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)軟骨機(jī)制中的代謝成分向正常方向改變，并且還可提高細(xì)胞的耐受力，對軟骨的降解起一定的緩解作用，具有良好延緩軟骨退變的作用。從基質(zhì)著色改變方面觀察：模型組動物開始即有基質(zhì)著色的淺弱和不均，表現(xiàn)更為嚴(yán)重，有些部位則全部丟失，壯骨關(guān)節(jié)丸組、中劑量組、高劑量組也有著色的減少，但減少程度輕，中劑量組趨于正常。實(shí)驗(yàn)組在丟失嚴(yán)重的部位見到軟骨細(xì)胞周圍的濃染，說明軟骨細(xì)胞仍在旺盛地合成基質(zhì)，揭示用藥組的軟骨細(xì)胞受到藥物影響，具有更強(qiáng)、更持久的合成基質(zhì)的能力。本實(shí)驗(yàn)表明桑生除痹合劑可以減少或阻斷軟骨片的丟失和刺激滑液分泌的途徑，修復(fù)損害的軟骨，延緩軟骨退變，對膝OA滑膜增生和炎細(xì)胞浸潤有抑制作用，對OA病變發(fā)展有抑制作用，其中中劑量組療效更佳。

研究表明靜脈瘀滯、骨內(nèi)高壓可能是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的原發(fā)因素，骨內(nèi)微循環(huán)障礙是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。骨內(nèi)靜脈瘀滯首先是微循環(huán)瘀滯，從而引起骨內(nèi)高壓的主要因素已獲普遍認(rèn)可。在形成骨內(nèi)高壓這一過程中，血液流變學(xué)異常表現(xiàn)為：血細(xì)胞壓積增加，全血和血漿比粘度增加，血漿纖維蛋白原增加，凝血速度加快，紅細(xì)胞和血小板在血漿中電泳緩慢，紅細(xì)胞沉降率加快。由于這些變化，使血液運(yùn)行不暢，易致血栓形成、血管栓塞，靜脈回流受阻。靜脈瘀滯引起骨內(nèi)壓力升高，進(jìn)而導(dǎo)致骨內(nèi)血液灌注量減少，使骨內(nèi)呈貧血狀態(tài)，造成骨髓組織缺血、缺氧，酸性代謝產(chǎn)物聚積，滑膜也因關(guān)節(jié)內(nèi)高壓而使血流量減少，靜脈郁積導(dǎo)致滑膜分泌酸性滑液，微循環(huán)系統(tǒng)的局部反饋機(jī)制失調(diào)，毛細(xì)血管周圍肥大細(xì)胞釋放組織胺，血漿外滲，引起組織水腫及微循環(huán)血液的濃縮，血栓形成，從而導(dǎo)致血液灌注量進(jìn)一步減小，骨內(nèi)壓和關(guān)節(jié)內(nèi)壓進(jìn)一步升高，如此形成惡性循環(huán)[2]，不可避免的破壞局部組織的正常理化環(huán)境，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，全血黏度、全血還原粘度模型組和壯骨關(guān)節(jié)丸組、中劑量組、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，紅細(xì)胞聚集指數(shù)模型組和壯骨關(guān)節(jié)丸組、高劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模3月后血液粘滯性增加，經(jīng)藥物干預(yù)后可明顯改善血液粘滯性，其中以高劑量組最佳，療效與劑量呈相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了桑生除痹合劑能顯著改善血液流變學(xué)狀態(tài)，從而達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。

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