骨髓間充質干細胞移植大鼠缺血心肌后GATA-4 mRNA的表達

黃獻平，鄭景輝，袁肇凱*，李勇華，王麗萍，簡維雄，孫貴香

（湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學國家重點學科，國家中醫(yī)藥管理局病理生理實驗室，湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208）

心肌缺血性疾病一直是臨床治療的難點。心肌缺血引起心肌細胞壞死、凋亡，造成心肌數目減少，心室重構促使心力衰竭發(fā)生。通常認為心肌細胞是終末分化細胞，缺乏增殖分化能力，損傷后不能再生。近年來研究表明，通過MSCs移植改善缺血心肌功能，重建梗死心肌喪失的心肌細胞以治療缺血性心臟病，顯示有良好的臨床應用前景，已成為國內外心血管病研究領域的熱點［1－3］。 GATA－4 基因是心臟前體細胞的最早期標志之一，調節(jié)心肌細胞的發(fā)生、分化及心臟前體細胞形成線狀肌管。本研究通過觀察MSCs移植于大鼠缺血心肌后，心臟早發(fā)基因GATA－4 mRNA的表達，探討干細胞向心肌細胞分化的分子基礎，并為深入研究干細胞移植機制提供實驗依據。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，體質量 （130±20）g，造模大鼠體質量（240±20） g，均購自湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。動物許可證號：SCXK （湘）2009－0004。

1.1.2 試劑 培養(yǎng)基 L－DMEM，美國 GIBCO 公司；特級胎牛血清，北京Hyclone公司；5－氮胞苷，美國Sigma公司； FITC 標記 CD11b、CD45、CD90抗體，美國SERANTEC公司；Trizol，美國 Invitrogen公司；逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒，加拿大Fermentas公司；聚合酶鏈反應（PCR）引物，Invitrogen公司。

1.1.3 引物 在NCBIGenbank公布的引物序列，使用Primer Premier5.0進行設計。由Invitrogen公司合成。見表1。

表1 PCR引物序列及擴增目的片段大小

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離與培養(yǎng) 雄性SD大鼠頸椎脫臼法處死，在75%乙醇中浸泡10 min。在無菌條件下快速取脛骨和股骨，去除周圍組織，切除脛骨和股骨兩端，用DMEM液反復沖洗骨髓腔，將沖洗液收集于離心管中，1 500 r／min離心5 min，棄上清液。加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，反復吹打，細胞計數后以109／mL密度接種于50 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和濕度、含體積分數為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)。48 h后棄懸浮液，首次換液。以后每2 d換液1次。

1.2.2 MSCs的傳代及純化 待原代培養(yǎng)的細胞增殖在瓶底融合基本達到80%左右時，用0.25%胰酶消化細胞后，加培養(yǎng)液終止消化并反復吹打貼壁細胞，制成單細胞懸液，按1∶2傳代培養(yǎng)，并標記為P2，以后每天觀察細胞的生長情況，直至貼壁細胞彼此融合達到80%左右時，重復上述操作，反復傳至第4代。

1.2.3 MSCs 的鑒定 取第 4 代 MSCs，0.25%胰酶消化后配制成細胞懸液，1%BSA封閉液10 min，PBS洗滌3次，加入FITC熒光標記的抗CD11b、CD45、CD90抗體，對照組加 PBS，4 ℃孵育 30 min，1 500 r／min離心 5 min，PBS沖洗 3次，以 1%多聚甲醛固定，采用FACScan流式細胞儀檢查細胞表面抗原。

1.2.4 大鼠MSCs細胞懸液配制 用胰蛋白酶消化后離心收集細胞，計數，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，配制成3×106／100μL濃度的細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 動物造模 取健康清潔級雄性SD大鼠30只，適應性飼養(yǎng)觀察1周。隨機取8只作為空白組，取8只作為假手術組，其余作為模型組。參考文獻方法［4］將缺血心肌組大鼠腹腔麻醉，仰臥位固定，呼吸機呼吸，行心電監(jiān)測，左胸縱切口分層開胸，在肺動脈圓錐和左心耳之間，距左冠狀動脈起始2 mm處5～0號無創(chuàng)傷絲線結扎左冠脈前降支，使左室前壁失去原有光澤而變蒼白，出現搏動減弱，心電監(jiān)測見肢體導聯R波振幅明顯升高，隨后出現I導聯和aVL導聯J點明顯抬高，提示大鼠AMI造模成功。

1.2.6 分組處理 ①模型組 將造模成功的大鼠結扎30 min后，于梗死區(qū)邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100μL的MSCs細胞懸液 （含細胞數3×106），常規(guī)關閉胸腔。術后腹腔注射青霉素預防感染，單籠飼養(yǎng)。②假手術組 給大鼠開胸后，只穿線不做結扎。30 min后，與模型組相同注射部位的3個位點直接注入共100μL的MSCs細胞懸液，隨后的處理同模型組。③空白對照組 給大鼠開胸后，與模型組相同注射部位的3個位點直接注入共100μL的MSCs細胞懸液，隨后的處理同模型組。各組28 d后處死，取出心臟切下約100 mg放入冷凍管保存在液氮中備用。

1.2.7 檢測GATA－4mRNA的表達 ①組織總RNA的提取，整個提取操作過程要在低溫無菌進行。取100 mg組織剪碎，加Trizol試劑1 mL，抽吸混勻，室溫靜置10 min；加三氯甲烷0.2 mL，混勻，室溫靜置 10 min；4 ℃，12 000 r／min 離心 10 min；仔細吸取上層水相，移入另一管中，加0.5 mL異丙醇，置室溫 10 min；4 ℃，12 000 r／min 離心 10 min；加 75%乙醇1 mL混勻，充分洗滌沉淀；4℃，7 500 r／min離心5 min；棄去上清液，室溫靜置5 min，用40μL水重懸，貯存于－70℃?zhèn)溆?。②經電泳鑒定其完整性后，利用紫外分光光度計測定A260與A280的比值，并計算其濃度。③mRNA的反轉錄cDNA合成，在 EP 管中加入模板 RNA3μg，oligo （dT）18 primer 1μL加至11μL，離心30 s；65℃水浴5 min后，立刻0℃冰水浴1 min；短暫離心后，冰上操作：加入 4 μL 5×First－Strand Reaction Buffer，1uL MMuLV逆轉錄酶；離心30 s，37℃水浴60 min進行逆轉錄；70℃水浴5 min滅活逆轉錄酶，－20℃保存，或立即進行PCR。④PCR擴增逆轉錄產物，采用的引物同前述所用引物，25μL反應體系。反應條件為：94℃預變性5 min，進入PCR循環(huán)，94℃變性30 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，結束反應。⑤PCR產物電泳鑒定，用2%瓊脂糖凝膠為載體，上樣量為12μL，電壓為60 mV，電泳60 min后，置凝膠掃描儀呈像系統(tǒng)下用圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集，每幅圖像使用Image－Pro Plus 6.0軟件編制宏按統(tǒng)一原則進行分析測量。掃描分析GATA－4、內參β－actin的光吸收差值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MSCs表面抗原的鑒定結果

應用FACScan流式細胞儀檢查細胞表面抗原CD11b和CD45陽性細胞率均達到98%以上，CD90陽性率小于2%。結果顯示細胞均一性較好，純度較高。見圖1。

圖1 大鼠MSCs細胞CD11d，CD45和CD90表達流式細胞記錄圖

2.2 RNA的鑒定

提取的心肌組織總RNA，經紫外分光光度計檢測，所有樣品OD260／OD280值均在1.7以上，表明其純度符合要求。

2.3 MSCs移植缺血心肌后GATA-4 mRNA的表達

用GATA-4 mRNA基因序列設計的特異性引物進行的RT-PCR產物，經電泳分離表明，MSCs移植AMI模型組和模型對照組心肌后28 d的大鼠心肌中存在GATA-4 mRNA的表達，電泳圖上見一683 bp條帶；而空白對照組的心肌中未檢出GATA-4 mRNA的表達，對其IOD值半定量分析，模型組高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2和表2。

圖2 MSCs移植缺血心肌后GATA-4 mRNA-RT-PCR電泳圖譜

表2 MSCs移植缺血心肌后GATA-4 mRNA的表達（n=8，x±s）

3 討論

MSCs具有保持未分化特性無限增殖的能力，并且能夠分化為包括心肌細胞在內的各種類型的細胞［5］。GATA-4是GATA基因家族的重要成員之一，含有高度保守的DNA結合域，此結構域由2個鋅指結構序列構成。GATA-4在心臟早期便開始表達，并在心肌和心臟其他組織中持續(xù)表達。生物學的研究表明GATA-4基因在心肌發(fā)生中扮演重要角色，是MSCs向心肌細胞分化的重要啟動基因和心臟前體細胞的最早標志之一。

心臟的發(fā)育是具有時間和空間協(xié)調一致性的復雜遺傳過程，主要由細胞之間的信號轉導及基因表達進行精確調控。干細胞橫向分化的機制與誘導心臟發(fā)生的分子調控機制密切相關。本研究應用RT-PCR檢測技術定量分析了心臟轉錄因子GATA-4 mRNA基因在MSCs移植后的表達差異。結果顯示，空白對照組的心肌中未檢出GATA-4 mRNA的表達，模型組高于其他兩組。說明MSCs在進入缺血心肌環(huán)境后，細胞內的心肌特異轉錄過程被再次激活，確立了向心肌細胞分化的方向，GATA-4活化后會導致下游調控基因級聯式激活，最終合成特異靶蛋白。因此GATA-4在心臟發(fā)育過程中的作用可能是通過調控許多心臟結構基因的表達，包括心臟肌球蛋白重鏈、心肌鈣蛋白C等，以及通過其鋅指結構與其他心臟特異性的轉錄因子等相互作用形成復合物發(fā)揮轉錄調控作用，從而調節(jié)心臟發(fā)育［6-7］。

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