一株光合細(xì)菌的鑒定及其處理大豆加工廢水試驗(yàn)

盧海鳳，張光明，何春華

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090哈爾濱，zgm200@126.com)

自20世紀(jì)60年代日本科學(xué)家M.Kobayashi等發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌(PSB)具有能夠凈化水質(zhì)的作用以來(lái)，光合細(xì)菌就一直受到關(guān)注[1].光合細(xì)菌是一大類(lèi)在厭氧條件下進(jìn)行不放氧的光合作用細(xì)菌的總稱(chēng)，其分布廣泛，種類(lèi)繁多.文獻(xiàn)[2－3]將其劃分為綠硫細(xì)菌、紅硫細(xì)菌、紅螺菌3科.其中紅螺菌能在厭氧光照的條件下以低級(jí)脂肪酸、多種二羧酸、醇類(lèi)、糖類(lèi)、芳香族化合物等低分子有機(jī)物及二氧化碳等作為光合作用的電子供體進(jìn)行光能異養(yǎng)生長(zhǎng)，而且能在微氧黑暗條件下，以上述有機(jī)物為呼吸基質(zhì)，進(jìn)行好氧異養(yǎng)生長(zhǎng).另外，光合細(xì)菌還具有繁殖速度快(優(yōu)于厭氧法)、能耗低(優(yōu)于好氧法)和無(wú)需污泥處置[3]等優(yōu)點(diǎn)在污水治理領(lǐng)域逐步得到推廣應(yīng)用[4－10].光合細(xì)菌菌體無(wú)毒、含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多種B族維生素、泛酸、輔酶Q等生理活性物質(zhì)以及菌綠素、類(lèi)胡蘿卜素等天然色素，具有很強(qiáng)的回收價(jià)值[11－16].基于光合細(xì)菌在水處理和資源回收等方面的優(yōu)勢(shì)，對(duì)從土壤中富集分離出的一株新型光合細(xì)菌進(jìn)行了生理生化以及菌種鑒定，并初步探討了其對(duì)大豆加工廢水的處理效果，發(fā)現(xiàn)在自然光微氧條件下，該菌株對(duì)大豆加工廢水的COD具有較好的降解作用，比傳統(tǒng)的光照厭氧及黑暗好氧條件下利用PSB處理高濃度有機(jī)廢水在工程上的應(yīng)用更具有現(xiàn)實(shí)意義.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備見(jiàn)表1.

表1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種形態(tài)及生理生化性質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)

1)菌種單、復(fù)染色試驗(yàn):參考文獻(xiàn)[17];

2)原子力顯微鏡掃描:將原始菌液1 000 r/min離心10 min，取上清液3 000 r/min離心10 min，棄上清沉淀部分加入pH為7.2的磷酸鹽緩沖液2 mL，洗滌離心10 min，如上洗滌3～5次即可.將洗滌好的菌體加入磷酸鹽緩沖液少許并稀釋到合適的質(zhì)量濃度進(jìn)行原子力顯微拍照;

3)菌種的碳源利用試驗(yàn):參考文獻(xiàn)[17];

4)菌種吸收峰點(diǎn)試驗(yàn):將菌液用無(wú)菌水稀釋至OD660=1.000左右，將該菌液在紫外分光光度計(jì)上100～1 000 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄峰點(diǎn);

5)Sherlock MIS鑒定試驗(yàn):詳見(jiàn)sherlock MIS系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū);

6)光密度OD660:國(guó)標(biāo)法，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[18].

1.2.2 處理大豆加工廢水條件及效果實(shí)驗(yàn)

1)廢水:采用人工配水方式，用豆?jié){配制初始COD 為8 000～12 000 mg·L－1的污水;處理溫度為26～28℃;

2)投菌量:采用稱(chēng)重法設(shè)置投菌量(干質(zhì)量)為8、40、160、400、960、1 920 mg·L－1的 6 個(gè)處理;

3)光照及氧氣條件:光照厭氧(光強(qiáng)為1 000 lx)、自然光微氧(保持溶解氧 DO＜0.5 mg·L－1)以及黑暗好氧(保持DO介于2.0～4.0 mg·L－1)3個(gè)處理，投菌量為120 mg/L;

4)COD:國(guó)標(biāo)法，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[18];

5.統(tǒng)一規(guī)范，把好項(xiàng)目資料關(guān)。規(guī)范基礎(chǔ)工作是審計(jì)項(xiàng)目順利開(kāi)展的前提和保障，審計(jì)組長(zhǎng)在強(qiáng)化審計(jì)項(xiàng)目質(zhì)量的同時(shí)，要擯棄“重成果、輕基礎(chǔ)”的錯(cuò)誤導(dǎo)向，按照“規(guī)范、全面、標(biāo)準(zhǔn)”的要求，實(shí)行審計(jì)基礎(chǔ)工作標(biāo)準(zhǔn)化管理，保證審計(jì)資料歸檔的及時(shí)性、準(zhǔn)確性、完整性，促進(jìn)審計(jì)質(zhì)量和工作效率的提高。

5)生物量采用烘干法，即MLSS測(cè)定方法，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[18].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種及生理生化性質(zhì)鑒定

2.1.1 光合細(xì)菌Z08單染色試驗(yàn)及原子力掃描鏡試驗(yàn)

由圖1，2可知，該菌的細(xì)菌菌體為球狀，單個(gè)細(xì)菌的直徑約為0.3～1.0 μm.光合細(xì)菌Z08復(fù)染色過(guò)程中的顏色變化為:紫色→紅色→無(wú)色→紫色，故Z08為G－.

圖1 100倍光學(xué)顯微鏡下Z08菌體圖像

圖2 光合細(xì)菌Z08的原子力鏡掃描照片

2.1.2 光合細(xì)菌Z08的碳源利用試驗(yàn)

由表2可知，該菌能夠在以乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘露糖、甘露醇、山梨醇等小分子有機(jī)物為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌能夠利用此類(lèi)有機(jī)物進(jìn)行新陳代謝;而不能利用丙酸鈉、硫代硫酸鈉、甲基纖維素、油酸鈉及蛋白質(zhì)作為碳源進(jìn)行代謝.

2.1.3 光合細(xì)菌Z08的菌液特征吸收峰點(diǎn)試驗(yàn)

2.1.4 光合細(xì)菌菌種鑒定

經(jīng)微生物鑒定自動(dòng)化系統(tǒng)Sherlock MicrobialIdentification System(MIS)鑒定，該菌種為球形紅單假單胞菌:Rhodobacter－sphaeroides(Rhodopseudomonas sphaeroides)，MIS圖譜見(jiàn)圖3，對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)圖譜來(lái)源于美國(guó)MIDI公司，相似度為0.838(相似度＞0.7鑒定可靠).

表2 Z08的碳源利用情況

表3 菌液特征吸收峰點(diǎn)

圖3 GH－1脂肪酸－IC法鑒定圖譜

圖4為該菌株16srDNA序列鑒定結(jié)果，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析:該菌株16S rDNA序列與Rhodobacter sphaeroides KD131 (CP001151)、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029(CP00578)、Rhodobacter sphaeroides IFO 12203(D16425)等相似性為100%.可以確定其分類(lèi)地位屬于Rhodobacter sphaeroides.

2.2 處理大豆加工廢水條件優(yōu)化及效果

2.2.1 投菌量

如圖5所示，各處理組的COD去除率隨處理時(shí)間的增加逐漸升高，前72 h增加最快，72 h后數(shù)值變化趨于平緩，逐漸達(dá)極限值.投菌量為160與400 mg·L－1的處理組在第72小時(shí)時(shí)，COD的降解率分別達(dá)86.8%與81.9%，在96 h時(shí)，上述數(shù)值分別達(dá)93.7%與90.5%;菌種添加量為960與1 920 mg·L－1的處理組中，前96 h時(shí)的COD去除率均小于菌種投加量為160與400 mg·L－1的組合，而在第96小時(shí)以后，其去除率數(shù)值與160和400 mg·L－1的處理組相差不大;菌種添加量為8、40與80 mg·L－1的處理組COD去除率在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均小于其他菌種添加量≥160 mg·L－1的4個(gè)處理組.綜合考慮每個(gè)處理組的COD降解效果、菌種添加量的經(jīng)濟(jì)性與處理時(shí)間的長(zhǎng)短可以得出，利用Z08處理大豆加工廢水最佳的投菌量為160～400 mg·L－1，處理時(shí)間為72 h.

圖4 球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)進(jìn)化樹(shù)

圖5 大豆加工廢水中COD去除率隨投菌量變化

2.2.2 光照氧氣

從圖6中可以看出，各處理組的COD值隨處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，且同一時(shí)間點(diǎn)上，各組COD去除率的趨勢(shì)為黑暗好氧＞自然光微氧＞光照厭氧;在前72 h內(nèi)，各組COD值下降最快，72 h后各組COD值變化相對(duì)平緩，逐漸達(dá)到處理極限值;在第72小時(shí)時(shí)，各組COD去除率相差不大，而在第168小時(shí)時(shí)，各組對(duì)COD的去除率為:黑暗好氧(95.1%)＞自然光微氧(91.9%)＞光照厭氧(83.4%).另外，在第72小時(shí)時(shí)，各處理組的菌體產(chǎn)量分別為:自然光微氧(2 125 mg·L－1)＞光照厭氧(1 350 mg·L－1)＞黑暗好氧(862.5 mg·L－1)，綜合處理效果、經(jīng)濟(jì)節(jié)能性以及菌體產(chǎn)量，自然光微氧為最佳處理?xiàng)l件.從COD去除效果的角度考慮，自然光微氧條件下對(duì)污水中COD的去除效果與黑暗好氧條件下的相差不大，且優(yōu)于光照厭氧條件.而高濃度有機(jī)廢水由于透光性差，氧氣傳質(zhì)差，需要通過(guò)設(shè)置高光強(qiáng)的照明器以及高強(qiáng)度的曝氣來(lái)分別控制污水處理過(guò)程中的嚴(yán)格光照厭氧與黑暗好氧條件，因此，相比之下，在自然光微氧條件下的PSB處理高濃度有機(jī)廢水工藝在工程上的應(yīng)用更具有現(xiàn)實(shí)意義.

圖6 大豆廢水中COD質(zhì)量濃度隨光照氧氣組合變化

3 結(jié)論

1)從土壤中富集分離的菌株Z08經(jīng)Sherlock MIS系統(tǒng)鑒定及16S rDNA序列測(cè)定，判斷其為Rhodobacter sphaeroides，菌體為球狀，單個(gè)細(xì)菌的直徑約為0.3～1.0 μm，屬于革蘭氏陰性菌.Z08能夠在以乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘露糖、甘露醇、山梨醇等小分子有機(jī)物為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而不能利用丙酸鈉、硫代硫酸鈉、甲基纖維素、油酸鈉及蛋白質(zhì)作為碳源進(jìn)行代謝.

2)處理溫度為26～28℃條件下，投菌量為160～400 mg·L－1時(shí)，Z08對(duì)大豆加工廢水 COD的去除率最佳.

3)在不同的光照氧氣組合條件中，自然光微氧組合處理?xiàng)l件最佳，第72小時(shí)時(shí)對(duì)COD的去除率達(dá)73.5%，菌體產(chǎn)量與光照厭氧及黑暗好氧兩個(gè)處理組相比達(dá)到最大，為2 125 mg·L－1.

[1]小林正泰(日).光合細(xì)菌處理高濃度有機(jī)廢水[J].發(fā)酵與工業(yè)，1978，36(9):753－760.

[2]R.E?？材?伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京:北京科學(xué)出版社，1984.

[3]東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社，2001.

[4]BAI H，ZHANG Z，YANG G，et al.Bioremediation of cadmium by growing Rhodobacter sphaeroides:kinetic characteristic and mechanism studies[J].Bioresource Technology，2008，99(16):7716－7722.

[5]EROGLU E，GUNDUZ U，YUCEL M，et al.Photosynthetic bacterial growth and productivity under continuous illumination or diurnal cycles with olive mill wastewater as feedstock[J].International Journal of Hydrogen Energy，2010，35:5293－5300.

[6]KAEWSUK J，THORASAMPAN W，THANUTTAMAVONG M，et al.Kinetic evelopment and evaluation of membrane sequencing batch reactor(MSBR)with mixed cultures photosynthetic bacteria for dairy wastewater treatment[J].Journal of Environmental Management，2010，91:1161 －1168.

[7]LU H F，ZHANG G M，DAI X，et al.Photosynthetic bacteria treatment of synthetic soybean wastewater:direct degradation of macromolecules[J].Bioresource Technology，2010，101:7672－7674.

[8]MYUNG K K，CHOI K M，YIN C R，et al.Odorous swine wastewater treatment by purple non－sulfur bacteria，Rhodopseupdomonas pulustris，isolated from eutrophicated ponds[J].Biotechnology Letter，2004，26:819－822.

[9]PONSANO E H G，PAULINO C Z，PINTO M F.Phototrophic growth of Rubrivivax gelatinosus in poultry slaughterhouse wastewater[J].Bioresource Technololgy，2008，99(9):3836－3842.

[10]SIRIANUNTAPIBOON S，SRIKU M.Reducing red color intensity of seafood wastewater in facultative pond[J].Bioresource Technology，2006，97(14):1612－1617.

[11]TIANA Y，YUEA T，YUANA Y，et al.Improvement of cultivation medium for enhanced production of coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum[J].Biochemical Engineering Journal，2010，51:160－166.

[12]秦娟.光合細(xì)菌成分的研究及光合細(xì)菌制劑降血脂藥效學(xué)初步篩選[D].太原:山西醫(yī)科大學(xué)，2009.

[13]李福枝，劉飛，曾曉希，等.光合細(xì)菌(PSB)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2009，24(1):152－156，158.

[14]王劍秋，管云濤，騰飛.光合細(xì)菌法降解淀粉廢水積累菌體蛋白的研究[J].清華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，47(3):348－351.

[15]李福枝，劉飛，鄧靖.沼澤紅假單胞菌中類(lèi)胡蘿卜素的提取與分析[J].生物技術(shù)，2007，11(1):51－53.

[16]LORRUNGRUANG C，MARTTHONG J，SASAKI K，et al.Selection of photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides 14F for polyhydroxyalkanoate production with two－stage aerobic dark cultivation[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，102(2):128－131.

[17]呂春梅.環(huán)境污染微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2006.

[18]國(guó)家環(huán)保局水和廢水分析方法編寫(xiě)組.水和廢水監(jiān)

測(cè)分析方法[M].北京:中國(guó)環(huán)境出版社，1989.