血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷*移中Ⅳ型膠原酶的作用研究

高 冬，陳文元，鄭良樸，林 薇，吳立婭，宋 軍，陳可冀

(1．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350108);2．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350108;3．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;4．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷*移中Ⅳ型膠原酶的作用研究

高 冬1，陳文元1，鄭良樸2，林 薇2，吳立婭1，宋 軍3△，陳可冀4

(1．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350108);2．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350108;3．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;4．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

目的:探討血府逐瘀湯影響Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。方法:運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，以1．25%、2．5%和5%濃度的血府逐瘀湯含藥血清和空白血清培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，采用Boyden小室遷移法檢測(cè)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響，并通過(guò)酶聯(lián)免疫法和RT-PCR檢測(cè)明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)分泌和表達(dá)的情況。結(jié)果:1．25%濃度含藥血清對(duì)上述指標(biāo)無(wú)影響，2．5%和5%濃度含藥血清可顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞遷移、MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9水平。結(jié)論:血府逐瘀湯通過(guò)提高Ⅳ型膠原酶的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，提示藥物促血管新生功能可能與該作用相關(guān)。

血府逐瘀湯;細(xì)胞遷移;MMP-2;MMP-29

血府逐瘀湯是臨床常用的活血化瘀經(jīng)典方，本項(xiàng)目組前期體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，從內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等不同角度、不同層面的系列工作均表明該方劑具有顯著的促血管新生作用，為該方劑治療缺血性疾病臨床療效提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)［1-6］，但藥物促血管新生多途徑、多靶點(diǎn)的復(fù)雜機(jī)制尚未闡明清晰。血管新生是在原有管腔基礎(chǔ)上，由內(nèi)皮細(xì)胞以出芽的方式擴(kuò)增、遷移并相互聯(lián)結(jié)形成血管內(nèi)膜腔，進(jìn)而成為新血管的過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是血管新生的關(guān)鍵步驟［7］，而Ⅳ型膠原酶在細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用，故本研究以內(nèi)皮細(xì)胞ECV304為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討Ⅳ型膠原酶在血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用，為該方劑促血管新生的藥效機(jī)制研究提供進(jìn)一步的支撐材料。

1 材料與方法

1．1 藥物制備

血府逐瘀湯中各藥量分別為當(dāng)歸9g，生地9g，桃仁 12g，紅花 9g，枳殼 6g，赤芍 6g，柴胡 3g，甘草6g，桔梗 4．5g，川芎 4．5g，牛膝 9g，購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。該方水煎2次煎液過(guò)濾，混合后加熱濃縮至含生藥量1．3g/ml、4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 含藥血清制備

6周齡 SD大鼠，體重150g±20g，雌雄各半，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(動(dòng)物批號(hào)NO．0037614)，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，隨機(jī)分為藥物組和空白對(duì)照組，每組6只。藥物組以13g/kg劑量灌胃給予血府逐瘀湯，空白對(duì)照組采用等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)7d，于第8天給藥2h后3%戊巴比妥鈉麻醉、腹主動(dòng)脈取血，靜置1h后，4000rpm離心30min分離血清，經(jīng) 56℃ 滅活 30 min，0．22μm 過(guò)濾除菌后，置－20℃保存。

1．3 試劑及設(shè)備

明膠，戊巴比妥鈉(美國(guó)，SIGMA公司)，GIBCOTMM199培養(yǎng)基干粉，Trizol，引物(美國(guó)，Invitrogen公司)，南美胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)、

1．4 HUVECs培養(yǎng)及含藥血清處理

HUVECs購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，采用含5%FBS的M199培養(yǎng)液，于37℃ 5%CO2中培養(yǎng)至匯合后同步化處理，以2．5×105個(gè)/ml密度接種，培養(yǎng)4h待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞隨機(jī)分成藥物組和空白組，分別更換1.25%、2．5%和5%血府逐瘀湯含藥血清和空白對(duì)照血清，繼續(xù)培養(yǎng)48h開展各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1．5 遷移實(shí)驗(yàn)

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液將其置于boyden小室的下室，中間置以0．5%明膠預(yù)包被的孔徑8μm的聚碳酸酯膜，上加入對(duì)應(yīng)組別的HUVECs2×104個(gè)，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。聚碳酸酯膜上室面的 HUVECs以棉簽輕輕刮去，下室面的HUVECs以中性甲醛固定，蘇木素常規(guī)染色，400×視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。

1．6 MMP-2和 MMP-9表達(dá)檢測(cè)

采用RT-PCR法，Trizol提取細(xì)胞內(nèi)總 RNA，取總RNA 1μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作按 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書進(jìn)行。引物序列見表1。

1．7 上清液MMP-2和MMP-9含量檢測(cè)

取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2．1 血府逐瘀湯對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

遷移實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果(圖1、表1)顯示，3個(gè)不同血清濃度的空白對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異，與空延伸 45s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)齊10 min后電泳檢測(cè) 白對(duì)照組相比，2．5% 和5．0%的含藥血清可提高細(xì)胞的遷移能力，使得遷移到下室面的細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P＜0．01)。

表1 EUSA檢測(cè)結(jié)果

圖1 血府逐瘀湯影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

表2 血府逐瘀湯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及Ⅳ型膠原酶的影響結(jié)果(±s，n=6)

表2 血府逐瘀湯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及Ⅳ型膠原酶的影響結(jié)果(±s，n=6)

注:與相同血清含量的空白組比較:*P ＜0．05，#P ＜0．01

檢 測(cè) 項(xiàng) 目 含藥血清量(%)空白血清量(%)1．25 2．5 5 1．25 2．5 5遷移數(shù)量(個(gè)) 47．50 ± 4．85 59．17 ± 7．03# 62．00 ± 6．36#38．00 ± 6．13 42．67 ± 6．06 43．17 ± 5．12 MMP-2 含量(ng/ml) 208．00 ±18．56 258．33 ±14．99# 289．50 ±10．01# 200．00 ±17．41 200．00 ±17．41 225．67 ±23．45 MMP-9 含量(pg/ml) 342．50 ±17．67 519．67 ±25．56* 608．83 ±33．18# 357．00 ±28．31 458．33 ±35．99 533．50 ±21．33 MMP-2 表達(dá)灰度值 0．18 ± 0．01 0．22 ± 0．01# 0．22 ± 0．01# 0．16 ± 0．01 0．18 ± 0．01 0．17 ± 0．01 MMP-9 表達(dá)灰度值 0．54 ± 0．01 0．67 ± 0．02# 0．71 ± 0．02#0．55 ± 0．01 0．56 ± 0．02 0．56 ± 0．02

圖2 血府逐瘀湯影響Ⅳ型膠原酶表達(dá)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．2 血府逐瘀湯對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果(圖2、表1)表明，與相同血清濃度的空白對(duì)照組相比，2．5% 和5．0%含藥血清可顯著提高M(jìn)MP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄水平(P＜0.01)。

2．3 血府逐瘀湯對(duì) MMP-2和 MMP-9含量的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，從3個(gè)不同血清含量的空白組來(lái)看，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2含量與血清濃度無(wú)關(guān)，而MMP-9水平隨著血清含量的升高呈上升趨勢(shì)，以5%空白血清組的含量最高，說(shuō)明培養(yǎng)體系中的血清含量?jī)H影響MMP-9的分泌。為了撇清血清的影響因素，采用藥物組與同等血清含量的空白組相比，其中2．5% 和5．0%含藥血清均可顯著提高上清液中MMP-2和MMP-9的水平，較低濃度的藥物無(wú)顯著影響，提示藥物具有提高M(jìn)MP-2和MMP-9含量的作用。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)因其活性需要 Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，MMPs幾乎能降解細(xì)胞基質(zhì)中的各種蛋白成分，在腫瘤侵襲、細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用進(jìn)并日益受到重視。目前MMPs家族已分離鑒別出26個(gè)成員，根據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為4類，而對(duì)Ⅳ型膠原酶的研究較深入。Ⅳ型膠原酶包括非糖化明膠酶A(MMP-2)和糖化明膠酶B(MMP-9)，兩者在結(jié)構(gòu)上除含有該家族所共有的氨基末端和鋅離子結(jié)合區(qū)域外，還在催化部位含有區(qū)別于其他家族成員的類似Ⅱ型類纖黏連蛋白的明膠結(jié)合部位，最大的結(jié)構(gòu)差異在于MMP-9多了一段長(zhǎng)度為54個(gè)氨基酸殘基的富含脯氨酸序列。它們都以酶原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，通過(guò)降解、破壞靠近細(xì)胞外基質(zhì)中的各類膠原和明膠等蛋白，使細(xì)胞沿著缺失的基質(zhì)膜向周圍組織遷移。

細(xì)胞基質(zhì)的水解和重建是血管新生所有步驟中最為重要的、影響到內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔的形成［8］，MMP-2和 MMP-9蛋白抑制劑能極大減弱內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［9］，MMP-2和 MMP-9缺失小鼠血管新生減弱［10-12］，而其抑制劑具有抑制血管新生的作用［13、14］，且內(nèi)皮細(xì)胞分泌的 MMP-2 無(wú)論對(duì)生理或病理性血管新生的具體步驟，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移等都是必不可少的［15、16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，血府逐瘀湯可通過(guò)升高M(jìn)MP-2和MMP-9的表達(dá)水平，提高內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)而發(fā)揮促血管新生作用。

MMPs的活性受到基因表達(dá)、酶原激活以及特異性抑制因子3個(gè)水平的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)藥物影響Ⅳ型膠原酶基因表達(dá)這個(gè)環(huán)節(jié)展開探討，要全面明確Ⅳ型膠原酶在血府逐瘀湯促內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制，還需要從另外兩方面進(jìn)一步深入研究。此外，聯(lián)系本項(xiàng)目組以往的研究工作我們發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯促內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用不僅與本研究的MMPs相關(guān)，還與VEGF、bFGF和 NO等血管新生調(diào)控因素關(guān)系密切［6］，這個(gè)現(xiàn)象不僅驗(yàn)證了藥物促血管新生的作用機(jī)制呈多途徑、多靶點(diǎn)的結(jié)論，而且為今后的探索拓展了新思路。

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The effect of type IV collagenase on endothelial cell migration induced by Xuefu Zhuyu Decoction

GAO Dong1，CHEN Wen-yuan1，ZHENG Liang-pu2，LIN Wei2，WU Li-ya1，SONG Jun3△，CHEN Kei-ji4
(1．College of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Tradition Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou350108，China;2．Fujian Academy of Integrative Medicine Fuzhou350108，China;3．The Experimental Research Center China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China;4．Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100091，China)

Objective:To investigate the effect of type IV collagenase on endothelial cell migration induced by Xuefu Zhuyu Decoction(XFZYD)．Methods:Serum pharmacology technique was adopted．Endothelial cells ECV304 were treated with blank serum or XFZYD containing serum(XFZYD-CS)at final concentrations of 1．25% ，2．5%and 5% ．Boyden chamber assay was performed to test cell migration function．ELISA and RT-PCR was used to estimate MMP-2 and MMP-9 level in cell supernatant and their transcription．Results:Final concentration of 2．5%and 5%XFZYD-CS promoted cell migration as well as MMP-2 and MMP-9 level and their transcription remarkably．Conclusion:XFZYD could induce ECV304 migration through high expression of MMP-2 and MMP-9．This might account for partial mechanism of angiogenesis effect induced by XFZYD．

Xuefu Zhuyu Decoction;cell migration;MMP-2;MMP-9

R285．5

B

1006-3250(2012)01-1341-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072933);福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007J0101);福建省“中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CKJ2008001)

2011-07-11

高 冬(1967-)，女，教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事血管新生研究，Tel:0591-22861151，E-mail:gd1026@yahoo．com．cn。

△通訊作者:宋 軍，Tel:010-64014411-3325，E-mail:junsong86@sohu．com。