補(bǔ)腎活血合劑對(duì)糖尿病性陽(yáng)痿大鼠陰莖平滑肌組織作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究*

張國(guó)豪，方再軍，張國(guó)治

(1．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053;2．貴州茅臺(tái)酒廠職工醫(yī)院，貴州 仁懷 564501;3．仁懷市人民醫(yī)院，貴州 仁懷 564500)

補(bǔ)腎活血合劑對(duì)糖尿病性陽(yáng)痿大鼠陰莖平滑肌組織作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究*

張國(guó)豪1，方再軍2，張國(guó)治3

(1．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053;2．貴州茅臺(tái)酒廠職工醫(yī)院，貴州 仁懷 564501;3．仁懷市人民醫(yī)院，貴州 仁懷 564500)

目的:觀察補(bǔ)腎活血合劑對(duì)糖尿病(DM)性陽(yáng)痿(ED)大鼠陰莖半滑肌組織的作用機(jī)理。方法:將實(shí)驗(yàn)小鼠用2%鏈脲佐菌素液按60mg/kg，腹腔注射建立糖尿病模型，然后在每只糖尿病模型大鼠頸項(xiàng)處注射阿樸嗎啡80ug/kg，錄像記錄陰莖勃起次數(shù)。篩選DM性ED模型，將DM性ED模型隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥高、低劑量組、達(dá)美康組、達(dá)美康 +安雄組。除正常組外，其余各組連續(xù)給藥l2周，然后處死測(cè)定陰莖海綿體膠原纖維，血竇結(jié)構(gòu)，平滑肌組織病理改變。結(jié)果:補(bǔ)腎活血活劑對(duì)膠原纖維，血竇結(jié)構(gòu)，平滑肌有改變。結(jié)論:補(bǔ)腎活血合劑對(duì)糖尿病陽(yáng)痿大鼠陰莖平滑肌有明顯效果。

補(bǔ)腎活血合劑;糖尿病;陽(yáng)痿;陰莖海綿體平滑肌

陰莖勃起功能障礙為糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)理醫(yī)學(xué)界分別從血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌，約物及心理因素等方面進(jìn)行了探討，但發(fā)病機(jī)理仍不很清楚。本文通過(guò)建立DM性 ED大鼠模型，主要從DM性ED大鼠陰莖平滑肌功能作用機(jī)理方面，通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)研究探討中藥對(duì)糖尿病性陽(yáng)痿的防治機(jī)理，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥品 補(bǔ)腎活血合劑(山淫羊藿、葛根、川芎等組成，生藥2g/ml，由四川省人民醫(yī)院制劑室制備;達(dá)美康，法國(guó)施維雅藥廠、天津華津制藥廠合作(80mg/片);安雄，南京歐加農(nóng)制藥有限公司(40mg/粒)。

1．1．2 動(dòng)物 健康 SD雄性大鼠 l20只，體重250g～300g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．1．3 儀器 日立全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)7170-A)，Y-計(jì)數(shù)儀(型號(hào) FJ200δ P，西安二六二廠)，O1ymPus光學(xué)顯微鏡(日本)，MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)，四川大學(xué)圖形圖像研究所提供。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物造模及分組 造模方法:禁食8h后，新鮮配制2%鏈脲佐菌素液按60mg/kg，對(duì)110只大鼠分別左下腹腔內(nèi)注射，5d后取血(取血前禁飼8h)，分離血清送成都中醫(yī)藥大學(xué)附院檢驗(yàn)科檢測(cè)血糖，選取血糖值在 11．1mmol/L～22．2mmol/L的大鼠進(jìn)入試驗(yàn)。

陰莖勃起試驗(yàn) 仿照文獻(xiàn)［1］造模方法。將大鼠放觀察箱適應(yīng)環(huán)境10 min，然后在每只大鼠頸項(xiàng)處注射阿樸嗎啡80ug/kg，AP0溶解于0．5mg/kg生理鹽水中，調(diào)整體積為5ml/kg。每只大鼠觀察30 min，錄像記錄陰莖勃起情況及勃起次數(shù)。陰莖頭充血及末端陰莖體出現(xiàn)為陰莖勃起1次，然后篩選ED病例作為DM性ED動(dòng)物模型。SD大鼠110只共造成DM模型 98只，98只中有 ED者61只，DM并ED62%，隨機(jī)分成5組:正常組:10只;模型組:12只;中藥高劑量組(相當(dāng)于成人劑量 10倍 5．4g/kg):12只;中藥低劑量組(相當(dāng)于成人劑量5倍2．7g/kg):12只;達(dá)美康組(相當(dāng)于成人劑量10倍22．86mg/kg):12只;達(dá)美康+安雄組(相當(dāng)于成人劑量10倍22．86mg/kg+11．84mg/kg):12只。以上各組均自由飲水，除正常組10只外，各組動(dòng)物均為12只，以上各治療組連續(xù)給藥12周后，經(jīng)股動(dòng)脈放血處死，摘除陰莖并測(cè)定陰莖體積及做相關(guān)免疫組化測(cè)定。

1．3 觀測(cè)指標(biāo)與測(cè)定方法

1．3．1 陰莖體積 用水取代法測(cè)量陰莖體積(單位 ml)。

1．3．2 血糖 用酶法檢測(cè)。

1．3．3 染色方法 陰莖海綿體膠原纖維、血竇結(jié)構(gòu)、平滑肌組織，用Masson三色染色法。

1．3．4 病理學(xué)檢測(cè)方法 (1)陰莖海綿體組織結(jié)構(gòu)的觀察:取相同部位陰莖海綿體組織(陰莖中后段)，10%中性甲醛液固定48h，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片8張，切片厚度4μm，其中第1張切片做Masson染色，第2～8張切片做免疫組化染色，操作步驟根據(jù)文獻(xiàn)［2］操作。在200×鏡下觀察Masson染色片陰莖海綿體組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果膠原纖維呈綠色，肌纖維呈紅色，紅細(xì)胞呈橘紅色;(2)Masson染色分析:每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野(200×)，定量測(cè)染色為紅色平滑肌，綠色膠原纖維和血竇的面積等二維參數(shù)。膠原表示，陰莖海綿體中膠原成分的變化，平滑肌表示陰莖海綿體組織中平滑肌成分的變化，血竇表示陰莖海綿體血管系統(tǒng)變化，以上變化反映對(duì)陰莖舒張的影響。

1．4 檢測(cè)指標(biāo)的意義

1．4．1 面積 截面的面積是形態(tài)定量分析中常用的參數(shù)。截面的面積等于落在截面內(nèi)的像素點(diǎn)計(jì)數(shù)乘以每個(gè)測(cè)試像素點(diǎn)所代表的測(cè)試面積(a=d2k2Pc)，單位 um2。

1．4．2 積分光密度(IOD) 表述被測(cè)個(gè)體截面積內(nèi)光密度的積分值，亦即是吸光物質(zhì)的總含量，IOD越大，說(shuō)明測(cè)定物質(zhì)的量或染色反應(yīng)后顏色越深，故量越多。

1．4．3 平均光密度 表述被測(cè)個(gè)體截面或投影輪廓單位面積內(nèi)吸光物質(zhì)各像素光密度的平均值，由積分光密度除以測(cè)試框內(nèi)像素?cái)?shù)目獲得。

1．4．4 平均黑度 即平均灰度，指被分析的圖像各部分染色顏色的平均深淺度，平均黑度越大，即染色越深，被染物質(zhì)的量越多。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3．1陰莖體積

表1顯示，各組實(shí)驗(yàn)大鼠陰莖體積比較無(wú)多大變化，比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠陰莖體積比較(±s)

表1 各組大鼠陰莖體積比較(±s)

組別 例數(shù)(只) 體積(單位ml3)正常組中低組模型組達(dá)美康組中高組達(dá) +安 組10 99999 0．45 ±0．15 0．40 ±0．11 0．38 ±0．16 0．40 ±0．17 0．41 ±0．20 0．39 ±0．18

3．2 陰莖膠原纖維、血竇和平滑肌

表2～4圖1～4顯示，模型組與正常組比較，膠原纖維含量增多;血竇的周長(zhǎng)和面積變小，竇腔變窄;平滑肌面積、平均黑度、平均光密度和積分光密度比正常組少。經(jīng)用中藥制劑治療后，陰莖膠原纖維含量減少，竇腔擴(kuò)張;平滑肌面積、平均光密度、積分光密度和平均黑度增多，與模型組比較有顯著性差異(P ＜0．01)。

表2 各組大鼠陰莖海綿體膠原纖維含量比較(±s)

表2 各組大鼠陰莖海綿體膠原纖維含量比較(±s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01;與模型組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01(下同)

組 別 例數(shù)(只) 面積(μm2)平均光密度 積分光密度 平均黑度正 常 組 10 1579．08 ±1197．04 156．97 ± 7．40 305935．06 ± 207957．92 65．11 ± 8．34中 低 組 9 3064．39 ±1258．43## 166．95 ±36．57## 496624．26 ± 250012．74## 71．38 ± 9．80##模 型 組 9 8878．89 ±4366．14＊＊ 192．47 ±11．34＊＊ 1486841．71 ± 703910．69＊＊ 98．03 ± 7．40＊＊達(dá) 美 康 組 9 3970．95 ±1188．60## 185．30 ± 6．35## 564935．47 ± 331737．92## 74．05 ±17．51##中 高 組 9 2549．48 ±1604．48## 159．89 ± 8．34## 424421．62 ±4610420．26## 69．69 ± 6．35##達(dá) + 安 組 9 4537．86 ±3227．88## 190．95 ±17．51## 784929．65 ± 234494．98## 95．84 ±37．28##

3．3 血糖

表5顯示，從各組實(shí)驗(yàn)大鼠比較可知，經(jīng)治療后各組與模型組比較血糖值下降有顯著性差異(P＜0．01)。

表6顯示，模型組同治療各組治療前后空腹血糖值無(wú)顯著性差異，與正常組比較有顯著性差異綿體平滑肌纖維受損、細(xì)胞數(shù)目減少、結(jié)締組織增多、血管粥樣硬化，血管障礙等有關(guān)［3、4］。

表3 各組大鼠陰莖海綿體血竇結(jié)構(gòu)的比較(±s)

表3 各組大鼠陰莖海綿體血竇結(jié)構(gòu)的比較(±s)

組 別 例數(shù)(只) 面積(μm2) 周長(zhǎng)(um) 最大直徑(um)正 常 組 10 9523．16±4137．98 493．87±122．22 150．07±16．73中 低 組 9 8505．49 ±4571．58 435．22 ±137．77 135．78 ±15．68模 型 組 9 4800．48 ±2306．33＊＊ 347．47 ±94．33 96．74 ±23．17＊＊達(dá) 美 康 組 9 5718．13 ±2038．76 398．91 ±150．53 118．86 ±38．07中 高 組 9 9254．00 ±1106．72## 493．22 ±127．49## 142．28 ±24．76##達(dá) + 安 組 9 5447．37 ±2464．91 352．49 ±184．33 105．43 ±35．19

表4 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織比較(±s)

表4 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織比較(±s)

組別 例數(shù)(只) 面積(μm2)平均光密度 積分光密度 平均黑度正 常 組 10 522．02 ±225．04 195．62 ±10．94 1955612．49 ±3950075．09 89．38 ± 10．94中 低 組 9 387．49 ±132．47## 185．08 ±12．78## 85671．76 ± 33466．75## 76．12 ± 8．25##模 型 組 9 288．24 ±117．41＊＊ 152．69 ±11．48＊＊ 43400．86 ± 26303．79＊＊ 61．65 ±12．12＊＊達(dá) 美 康 組 9 362．58 ±315．54## 178．88 ± 8．25## 74152．93 ± 58791．84## 69．70 ± 7．36##中 高 組 9 495．74 ±182．78## 185．88 ±16．72## 97742．03 ± 30661．30## 79．92 ±12．78##達(dá) + 安 組 9 346．21 ±144．64## 175．29 ± 7．36## 49484．59 ± 49290．93## 69．13 ±16．72##

表5 各組大鼠治療后空腹血糖(FBG)比較(±s)

表5 各組大鼠治療后空腹血糖(FBG)比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0．01;與模型組比較:#P＜0.05，##P ＜0．01，治療前后比較:△P ＜0.05，△△P ＜0．01

組別 例數(shù)(只) 治療前mmol/L 治療后mmol/L正 常 組10 6．25 ± 1．03 7．01 ± 1．12中 低 組 9 13．98 ±2．07△△ 10．45 ±1．21*##模 型 組 9 14．19 ±2．27△△ 31．88 ±4．59達(dá) 美 康 組 9 14．09 ±2．25△△ 8．96 ±2．42＊＊##中 高 組 9 14．01 ±3．15△△ 8．56 ±3．05＊＊##達(dá) + 安 組 9 3．88 ±2．14△△ 8．87 ±3．17＊＊##

在正常情況下，陰莖海綿體平滑肌松弛，動(dòng)脈血管擴(kuò)張，血流加快，陰莖脹大，陰莖海綿體壓力增強(qiáng)，靜脈閉阻，使達(dá)到能性交的勃起狀態(tài)，陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞在勃起過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。

組織學(xué)研究顯示，陰莖動(dòng)脈供血不足，海綿體內(nèi)膠原聚集導(dǎo)致勃起功能障礙，超微結(jié)構(gòu)的特征性改變使血管性勃起功能障礙的患者平滑肌細(xì)胞再生不良和萎縮及細(xì)胞外基質(zhì)(主要是膠原纖維)聚結(jié)。海綿體內(nèi)膠原成分的增加和海綿體血竇內(nèi)平滑肌細(xì)胞數(shù)的下降與勃起功能障礙有關(guān)。

勃起功能障礙病理在于海綿體平滑肌的改變，糖尿病并勃起功能障礙的病理表現(xiàn)在:平滑肌纖維數(shù)量減少，神經(jīng)組織受體減少或缺乏。特別是細(xì)胞內(nèi)收縮和舒張的基本結(jié)構(gòu)成分肌原纖維有明顯損害、早衰，膠原纖維增生，海綿體纖維化，從而使平滑肌收縮和舒張功能受到嚴(yán)重?fù)p害。在血管方面，陰莖小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮下層水腫，中膜肌層的肌纖維分離、纖維增生和鈣化，嚴(yán)重者則管腔狹窄。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織和Masson染色(顯示平滑肌細(xì)胞膠原組織和血竇)對(duì)陰莖海綿體染色結(jié)果進(jìn)行測(cè)量，顯示海綿體平滑肌、膠原纖維及血竇之間的關(guān)系。結(jié)果表明，中藥制劑治療后陰莖膠源纖維含量減少，竇腔擴(kuò)張，平滑肌面積，平均光密度、積分光密度和平均黑度增多，說(shuō)明中藥制劑具有改善陰莖膠原纖維、血竇和平滑機(jī)作用。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，陽(yáng)痿與消渴病病機(jī)演化密切(P＜0．01)，經(jīng)治療后，治療各組與模型組比較血糖值下降(P ＜0．01)。

4 討論

陽(yáng)痿即勃起功能障礙，其病理改變?yōu)槠交p少，膠原纖維發(fā)生增生，常表現(xiàn)為陰莖海綿體纖維化［3］。陽(yáng)痿是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥，主要是與糖尿病變引起外周血管疾病，特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、海相關(guān)。消渴病病理本質(zhì)是陰虛燥熱，陰損及陽(yáng)，轉(zhuǎn)化為氣陰兩虛，陰陽(yáng)俱損，腎陽(yáng)不振，溫煦失職，則前陰不能振奮而勃起，無(wú)論是氣陰兩虛，陰陽(yáng)俱損，命門(mén)火衰，都容易造成瘀血內(nèi)阻，消渴并發(fā)陽(yáng)痿，在瘀血的病機(jī)上都與腎密切相關(guān)，治療上補(bǔ)腎活血，溫陽(yáng)振痿。補(bǔ)腎活血合劑淫羊藿、川芎、葛根等組成，該方具有溫腎壯陽(yáng)，活血化瘀，降糖起痿功效。藥理研究表明，淫羊藿具有提高性機(jī)能，增加附性器官重量，提高血漿睪酮含量［5］，葛根、川芎活血化瘀，能使微循環(huán)血流加速，增大管徑，抑制血小板聚結(jié)，葛根素能降低血糖，因此該處方組成約物具有改善糖、脂代謝［6～9］，改善血液循環(huán)，提高機(jī)體免疫功能及抗衰老、提高性功能。抗自由基損傷，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和改善血管活性調(diào)節(jié)平滑肌舒張作用。通過(guò)以上綜合作用，保護(hù)陰莖海綿體平滑肌，抑制海綿體平滑肌及血竇，膠原纖維的病理改變。

［1］Heaton JP，W，Varrd S ．Theimpact of alcohol ingestion on erecrions in rats as measured by novei bioassay［J］．Juroi，1991，14(5):192．

［2］王伯運(yùn)，李玉松，黃高升．病理學(xué)技術(shù)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:142-143．

［3］吳明章，曾超文，張君慧．男性生殖病理學(xué)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997:260-261．

［4］張長(zhǎng)城，周安方，張茂林．補(bǔ)腎活血對(duì)精素靜脈曲張大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響［J］．湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25(4):10-12．

［5］黃世敬，翁維良．中藥臨床合理應(yīng)用手冊(cè)［M］．北京:金盾出版社，2009:53．63．284．

［6］魯 明，溫建余，祝麗霞．疏肝補(bǔ)腎活血法治療特發(fā)性高催乳素血癥勃起功能障礙的對(duì)照觀察［J］．四川中醫(yī)，2009，27(5):63-65．

［7］王洪海，李亞魯，催 海，等．補(bǔ)腎活血方藥對(duì)老年小鼠睪丸的影響［J］．中醫(yī)臨床康復(fù)，2004，8(24):5054-5055．

［8］王海松，段 華，程 斌．補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)糖尿病大鼠、血糖、血脂的影響［J］．成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)版，2005，28(2):45-48．

［9］勞國(guó)平．補(bǔ)腎活血理氣法治療糖尿病勃起功能障礙32例［J］．四川中醫(yī)，2005，23(2):59．

Experimental study on effect of Bushen Huoxue Heji on the tissue of corpus cavernosum smooth muscle in diabetic impotence rats

ZHANG Guo-hao，F(xiàn)ANG Zai-jun，ZHANG Guo-zhi
(1．Guang anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Science，Beijing100053，China;2．Hospital of Mao-Tai Chiew Factory in Guizhou Province，Renhuai，Guizhou564501，China;3．People’s Hospital of Renhuai，Renhuai，Guizhou564501，China)

Objective:Observing the effects of the reinforcing kidney and activating blood recipe affecting the tissue of corpus cavernosum smooth muscle of DMED-rats．Methods:An animal model of diabetes was induced by a single intravenous dose of streptozotocin(STZ，60mg/kg body weight)in Wistar rats．Recording the numbers of penile erection of eath rat by camera after subcutaneous inject of apomorphine(80μg/kg)．Screening the modle of STZ-rats with erectile dysfunction and grouping into 6 groups:control group，modle group，Chinese Medicine group，low-dosage group，Diamicron group，Diamicron combined Testosterone Undecanoate group，After administrating 12 weeks，observed the change of collagenous fiber of The penis sponge body，Blood sinus structure and the Organization pathological changes of Smooth muscle tissue Organization pathological changes．Results:the reinforcing kidney and activating blood recipe can improve the value of collagenous fiber of corpora cavernosa penis，Blood sinus structure and the Organization pathological changes of Smooth muscle tissue Organization．Conclusion:the reinforcing kidney and activating blood recipe has significant profective effect of the tissue of corpus cavernosum smooth muscle of DMED-rats．

reinforcing kidney and activating blood recipe;diabetes mellitus;erectile dysfunction;The penis sponge body smooth muscle

R285．5

B

1006-3250(2011)12-1338-03

貴州省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目(黔中發(fā)2005-30)

2011-02-26

張國(guó)豪(1968-)，男，貴州茅臺(tái)人，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，博士后，從事中西醫(yī)結(jié)合防治內(nèi)分泌系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病的臨床、科研與教學(xué)，Tel:13158126293，E-mail:mt zhang guo hao 163．com。